[發明專利]一種基于核酸適配體的熒光傳感器檢測抗生素的方法

在審

• 申請號: 202010728421.1
• 申請日: 2020-07-24
• 公開（公告）號: CN112011591A
• 公開（公告）日: 2020-12-01
• 發明（設計）人: 黃和;張幸;李昺之;林蕾;李靜敏;張立慧
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: C12Q1/44
• 分類號: C12Q1/44;G01N33/53;G01N21/64
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

本發明公開了一種基于核酸適配體熒光傳感器檢測抗生素的方法，該方法選擇可以與抗生素特異性結合的DNA單鏈作為適配體，并設計多條與適配體配對強度各異的互補鏈，利用熒光染料與雙鏈DNA的特性結合進行檢測。當加入抗生素時，抗生素和適配體互補鏈競爭與適配體結合，互補鏈被釋放，被隨后加入的核酸外切酶I(Exonuclease I)全部剪切。接著，利用雙鏈特異性熒光染料對DNA濃度進行報告檢測，得到抗生素濃度與熒光強度的關系并定量分析。本方法優點在于操作簡便，所需樣品量少，靈敏度高，且具有良好的實用價值，有望應用于醫療、環境、畜牧養殖業中抗生素的檢測。

技術領域

本發明涉及生物傳感器檢測方法，具體為一種基于核酸適配體的熒光傳感器檢測抗生素的方法。

背景技術

抗生素的生產和使用廣泛，據統計僅在中國每年就有約6000噸抗生素用于飼料添加劑，75％的抗生素不被動物機體吸收而隨動物糞便排出，導致畜禽養殖廢水成為自然界水體環境中抗生素污染的主要來源。抗生素殘留對人體健康有著十分嚴重的危害，包括致癌、致畸、致突變作用、人體對此類藥物的長期暴露，通常不會造成急性中毒，而主要是引起慢性中毒。抗生素污染已被視為一類新型的重要的水體污染物而成為國際研究的前沿課題。

磺胺類藥物為人工合成的抗菌藥，用于臨床已近50年，它具有抗菌譜較廣、性質穩定、使用簡便、生產時不耗用糧食等優點。磺胺間二甲氧嘧啶，常溫下為一種白色或類白色結晶或結晶形粉末，幾乎無味。不溶于水、氯仿，微溶于乙醇，可溶于丙酮，易溶于稀無機酸和強堿溶液。遇光易變質，色漸變深。磺胺間二甲氧嘧啶是一種長效磺胺原藥，其抗菌譜與磺胺嘧啶相似，但抗菌作用較強，適用于菌痢、腸炎、扁桃體炎、泌尿道感染、蜂窩織炎、皮膚化膿感染等疾病，吸入粉塵，皮膚接觸和不慎吞咽有害。對眼睛、呼吸道和皮膚有刺激作用。長期服用容易損傷腎功能及神經系統，磺胺藥中毒。

現有的抗生素分析檢測方法繁瑣，依賴HPLC、LC-MS等大型儀器，檢測所需時間且靈敏度有待進一步提升，所需樣品中抗生素的含量達到一定程度才能檢測出，所以需要進一步探索性能更好分析方法。

發明內容

發明目的：本發明的目的在于提供一種基于核酸適配體的熒光傳感器檢測抗生素的方法，該方法操作簡便，所需樣品量少，靈敏度高。

技術方案：本發明所述的基于核酸適配體熒光傳感器檢測抗生素的方法，將適配體與互補鏈結合，然后加入抗生素，抗生素和適配體互補鏈競爭性地與適配體結合，部分互補鏈被釋放，隨后加入核酸外切酶I，加入與DNA雙鏈結合的熒光染料，利用加入抗生素前后體系熒光信號的變化，實現對目標物的定量檢測。

所述的基于核酸適配體熒光傳感器檢測抗生素的方法，具體包括如下步驟：

(1)構建熒光適配體傳感器：將配好的濃度相同的適配體溶液與互補鏈溶液混合，加入含有緩沖液和抗菌水的離心管中，振蕩均勻；

(2)將步驟(1)中的離心管置于85-95℃振蕩儀中振蕩5-10min，取下自然冷卻后離心并混勻；

(3)加入不同體積或不同濃度的的抗生素溶液，在室溫下避光振蕩；

(4)加入核酸外切酶I，在室溫下避光振蕩；

(5)加入熒光染料，在室溫下避光振蕩10min-20min；

(6)轉移至酶標板中，測每個樣品的熒光強度。

所述的基于核酸適配體熒光傳感器檢測抗生素的方法，所述適配體的序列為：

5’-GAG GGC AAC GAG TGT TTA TAG A-3’；

所述互補鏈的序列為：

C:5′-TCT ATA AAC ACT CGT TGC CCT C-3′