[發(fā)明專(zhuān)利]一種基于凸起環(huán)鏈置換探針的基因突變熒光檢測(cè)方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010726030.6
• 申請(qǐng)日: 2020-07-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111778317A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-10-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝國(guó)明;白書(shū)連;李俊杰;薛建江;許榜田
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 重慶醫(yī)科大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6827
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6827;C12Q1/6886
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

調(diào)節(jié)分子探針與靶標(biāo)之間的自由能差值是實(shí)現(xiàn)選擇性識(shí)別DNA突變的可行方法。但是由于探針序列的變化程度有限，簡(jiǎn)單地通過(guò)改變探針的堿基組成來(lái)適度地利用熱力學(xué)仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。本專(zhuān)利通過(guò)在雙鏈DNA探針中插入凸起環(huán)來(lái)調(diào)節(jié)對(duì)突變的識(shí)別能力。通過(guò)可控性調(diào)節(jié)探針與突變或野生型DNA進(jìn)行鏈置換反應(yīng)之前和反應(yīng)之后的自由能變化，獲得了比常規(guī)線性探針高得多的特異性。本專(zhuān)利設(shè)計(jì)的凸起環(huán)探針對(duì)突變堿基有較好的識(shí)別效果，當(dāng)檢測(cè)2飛摩爾靶標(biāo)DNA時(shí)對(duì)突變的檢測(cè)限可以達(dá)到0.02％。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該檢測(cè)方法與液滴數(shù)字PCR(ddPCR)有高度一致性，并且可以用于鑒定商業(yè)熒光PCR試劑盒或Sanger測(cè)序無(wú)法識(shí)別的肺組織樣品中的低豐度L858R突變。上述結(jié)果表明，本專(zhuān)利在臨床肺癌相關(guān)突變分析方面具有商業(yè)轉(zhuǎn)化價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基因突變檢測(cè)方法，特別涉及一種基于凸起環(huán)(Bulge-loop)鏈置換探針的基因突變熒光檢測(cè)法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

癌癥源自基因突變的異常細(xì)胞不受控制的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。最常見(jiàn)的肺癌驅(qū)動(dòng)基因是表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)突變基因。其中，EGFR基因單核苷酸變異(SNV)是監(jiān)測(cè)肺癌患者癌癥狀態(tài)，EGFR酪氨酸激酶抑制劑(例如吉非替尼，厄洛替尼)治療效果，及遺傳易感性的重要檢測(cè)指標(biāo)。例如，EGFR基因第19外顯子上的L858R突變或缺失決定了患者對(duì)吉非替尼治療的敏感性，與此相反的，發(fā)現(xiàn)約有50％的對(duì)吉非替尼具有獲得性耐藥的肺癌患者在EGFR基因的外顯子20上攜帶T790M突變。

建立高特異性的點(diǎn)突變檢測(cè)方法將為臨床癌癥早期快速檢測(cè)和診斷提供有效的途徑。近年來(lái)，基于DNA雜交的分子探針因具備靈活的可編輯性，反應(yīng)條件溫和，不需要昂貴的分析儀器，易于推廣應(yīng)用而受到廣泛關(guān)注。已報(bào)道的基于DNA雜交的點(diǎn)突變檢測(cè)方法主要包括分子信標(biāo)，鏈置換反應(yīng)，級(jí)聯(lián)反應(yīng)，三莖DNA探針，以及共價(jià)修飾探針等。依靠沃森-克里克堿基配對(duì)的DNA探針的特異性與鏈置換反應(yīng)過(guò)程的吉布斯自由能變直接相關(guān)，反應(yīng)物的與產(chǎn)物吉布斯自由能的差值趨近于零時(shí)，探針具備最高的特異性。因此，一種可行的識(shí)別點(diǎn)突變的方法是調(diào)節(jié)探針與突變靶基因反應(yīng)的吉布斯自由能。通過(guò)改變DNA探針的堿基組成和熱力學(xué)結(jié)合強(qiáng)度來(lái)調(diào)節(jié)吉布斯自由能并不總是適用的，因?yàn)樵谠S多情況下，受突變靶基因和野生型靶基因的長(zhǎng)度和序列限制，僅允許對(duì)探針進(jìn)行有限程度的序列改變。

隨著化學(xué)生物學(xué)的發(fā)展，目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多具有可變局部和整體結(jié)構(gòu)特征的DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。具體而言，來(lái)自未配對(duì)核苷酸的雙鏈DNA的小缺陷將促進(jìn)Bulge-loop(BL)的形成。多項(xiàng)熱力學(xué)研究結(jié)果表明，以一條鏈為中心的單個(gè)凸起堿基將對(duì)雙鏈DNA的能量變化和穩(wěn)定性產(chǎn)生重大影響。受這些報(bào)道的啟發(fā)，我們?cè)诖耸状翁岢鐾ㄟ^(guò)將BL插入雙鏈DNA探針中來(lái)調(diào)節(jié)對(duì)突變的鑒別能力。該方法依賴于在存在突變或野生型DNA的情況下，對(duì)鏈置換反應(yīng)自由能變化的適度調(diào)節(jié)。通過(guò)研究在改變BL的長(zhǎng)度和位置時(shí)識(shí)別因子(DF，定義為突變體信號(hào)與野生型信號(hào)之間的比率)的變化，提出了設(shè)計(jì)對(duì)給定突變高度特異的BL鏈置換探針(BLP)的一般方法。通過(guò)BL結(jié)構(gòu)對(duì)探針特異性的可控調(diào)節(jié)，建立了基于BLP的基因突變熒光檢測(cè)法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是建立一種靈敏、特異、易于推廣且不需要特殊儀器的基因突變檢測(cè)方法。具體技術(shù)方案如下：

(1)、BLP設(shè)計(jì)通過(guò)將BL插入鏈置換探針中來(lái)調(diào)節(jié)對(duì)基因突變的鑒別能力。該方法依賴于在存在突變或野生型DNA的情況下，對(duì)鏈置換反應(yīng)自由能變化的適度調(diào)節(jié)。以立足點(diǎn)為7個(gè)堿基的鏈置換探針為例，設(shè)計(jì)了BL長(zhǎng)度為0-6nt，且定位于探針末端第7個(gè)堿基處的一系列探針，通過(guò)計(jì)算其對(duì)突變靶標(biāo)的識(shí)別因子來(lái)確定Bulge-loop結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度設(shè)計(jì)參數(shù)。設(shè)計(jì)了BL分別定位于探針末端第7個(gè)堿基處和/或定位于探針初始端第7個(gè)堿基處(將立足點(diǎn)初始端作為探針初始端)的四組探針，通過(guò)計(jì)算其對(duì)突變靶標(biāo)的識(shí)別因子來(lái)確定BL結(jié)構(gòu)位置設(shè)計(jì)參數(shù)。