[發明專利]一種研究雞PGCs中lncRNA和組蛋白甲基化酶共調控靶基因的方法

在審

• 申請號: 202010724836.1
• 申請日: 2020-07-24
• 公開（公告）號: CN111826430A
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發明（設計）人: 李碧春;張晨;左其生;張亞妮;孫紅艷
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12Q1/6876
• 分類號: C12Q1/6876;G16B25/10;G16B30/00
• 代理公司: 揚州蘇中專利事務所(普通合伙) 32222
• 代理人: 沈志海

一種研究雞PGCs中lncRNA和組蛋白甲基化酶共調控靶基因的方法，屬于生物技術領域。通過生物信息學分析將RNA?seq和CHIP?seq聯合篩選出受lncRNA和組蛋白甲基化酶共同調控的靶基因，為研究PGCs形成的表觀遺傳和遺傳機制網絡提供參考。

技術領域

本發明涉及一種研究雞PGCs中lncRNA和組蛋白甲基化酶共調控靶基因的方法，屬于生物技術領域。

背景技術

近年來，lncRNA調控機制集中于將染色質調節蛋白募集到基因組DNA位置上的研究。Rocha ST1等發現，刪除Xist lncRNA的離散區域（BF-重復結構域）會減少Xi上PRC2的募集，但不會影響 XCI74誘導過程中整個Xi的轉錄沉默或Xist定位；Wang KC等發現HOTTIP通過與WDR5蛋白物理性互作調控H3K4me3組蛋白修飾活性激活基因表達。盡管現有研究已從單一的lncRNA功能研究轉變為lncRNA與組蛋白修飾間的協同機制研究，但在雞PGCs上lncRNA和組蛋白甲基化酶共調控的靶基因的研究還未有挖掘。

作為精子和卵子祖先的原始生殖細胞，因其獨特的遷移方式成為鳥類的克隆、基因編輯和瀕危鳥類的拯救工作的良好材料。然而雞PGCs發生機制不清，導致體內分離和體外誘導均難以大量獲取來滿足實驗需要。PGCs形成的過程取決于多網絡精確調控，包括特異性轉錄因子，染色質修飾和信號傳導等途徑。研究表明，lncRNA通過多種機制調控基因的表達，包括與轉錄因子結合調控基因啟動；與miRNA形成內源性競爭機制等。盡管現有研究已從單一的lncRNA功能研究轉變為lncRNA與組蛋白修飾間的協同機制研究，但也僅僅停留在lncRNA募集單個染色質調節蛋白發揮功能。在PGCs形成中lncRNA和組蛋白甲基化酶共同調控的靶基因還未有研究。

發明內容

本發明的目的是針對上述現有技術的不足，提供一種研究雞PGCs中lncRNA和組蛋白甲基化酶共調控靶基因的方法，通過生物信息學分析將RNA-seq和CHIP-seq聯合篩選出受lncRNA和組蛋白甲基化酶共同調控的靶基因，為研究PGCs形成的表觀遺傳和遺傳機制網絡提供參考。

本發明的技術方案如下：

一種研究雞PGCs中lncRNA和組蛋白甲基化酶共調控靶基因的方法，包括：在雞PGCs中分別干擾lncRNA和過表達lncRNA，培養48h后，觀察熒光表達情況。提取RNA，進行RNA-seq測序。將獲得的測序結果進行分析，按照 log2（Fold Change）1或-1，P 0.05的原則獲得差異上調/下調的基因，對差異基因分別進行COG，GO注釋和KEGG通路分析。

首先對差異基因的功能和參與的信號通路進行大致的分析。利用獲得的差異上調/下調基因與組蛋白甲基化（H3K4me2）在PGCs上的CHIP-seq富集的基因進行Venny分析，GO注釋和KEGG通路分析，獲得與PGCs相關的關鍵信號通路。將其中的差異基因進行熱圖分析，分析其在不同處理中的RPKM值變化，篩選出干擾/過表達lncRNA后變化顯著的差異基因。結合ESCs和PGCs的RNA-seq數據，篩選出受lncRNA和組蛋白甲基化（H3K4me2）調控且在PGCs中高表達的差異基因。

接著利用在線CHIP-seq數據庫（http://cistrome.org/db/#/）對差異基因進行分析，選擇Mll2組蛋白甲基化酶復合體（ASH2L/DPY30/RBBP5/WDR5/MLL2）作為CHIP-seq的拉取蛋白進行生物信息分析。此時，可獲得組蛋白甲基化酶在不同差異基因中富集的評分，選擇評分高的富集蛋白進行驗證。

利用RIP 實驗驗證lncRNA和組蛋白甲基化酶的結合，利用CHIP-qPCR驗證組蛋白甲基化酶和差異基因的結合，。利用CHOP-qPCR驗證lncRNA和差異基因的結合。通過以上步驟可確定lncRNA和組蛋白甲基化共調控的關鍵靶基因。

本發明的有益效果如下：