[發明專利]用于LAMP檢測牛結核分枝桿菌的組合物、試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 202010722050.6
• 申請日: 2020-07-24
• 公開（公告）號: CN113969321A
• 公開（公告）日: 2022-01-25
• 發明（設計）人: 陶藝;蔡東洋;蘭英;王劍;杜文斌
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/6851;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京唐頌永信知識產權代理有限公司 11755
• 代理人: 劉偉

本申請提供一種用于環介導等溫擴增(LAMP)檢測牛結核分枝桿菌的組合物，試劑盒及其應用。本申請提供的環介導等溫擴增檢測牛結核分枝桿菌的組合物及其試劑盒可用于LAMP檢測和數字LAMP檢測中，可定性或定量檢測樣品中的牛結核分枝桿菌，具有高特異性、高靈敏度、耐核酸擴增抑制劑等優點，能夠實現對樣品中低濃度牛結核分枝桿菌的絕對定量，對于牛結核病的防控和流行病學的研究具有重大的應用價值。

技術領域

本申請屬于人畜共患病原菌檢測領域，具體地，涉及一種用于環介導等溫擴增(LAMP)檢測牛結核分枝桿菌的組合物、試劑盒，以及基于LAMP和數字LAMP檢測方法檢測樣品中牛結核分枝桿菌的應用。

背景技術

牛結核分枝桿菌屬于結核分枝桿菌復合群(Mycobacterium tuberculosiscomplex，MTBC)，牛結核分枝桿菌(Mycobacterium bovis)是引起牛結核病的病原菌。牛結核病是一種人畜共患的傳染病，世界動物衛生組織(Office international desépizooties，OIE)將其列為必須通報的疫病，在我國屬二類動物傳染病，該病可以通過病畜傳染給人類或其他動物，其在畜間主要易感染奶牛和役用牛，會引起役牛消瘦無力，甚至因心力衰竭而死亡；奶牛的產奶量下降且產出的牛奶中也含有病原菌。人結核病多發生于青壯年，特別是飲食營養差且從事繁重體力和腦力勞動的人感染此病的幾率更高。患者會出現抵抗力下降、身體消瘦、呼吸困難、咯血等癥狀，嚴重時會引起死亡。根據目前的研究，牛結核病感染人類一般發生在食用不經巴氏消毒的牛奶制品的特殊人群以及經常接觸畜牧業的人群中。

牛結核分枝桿菌的檢測方法主要包括細菌學檢驗、免疫學檢驗、分子生物學檢驗等方法。由于在細菌學檢驗中牛分枝桿菌的體外培養對營養要求苛刻，且生長緩慢，常規方法對其分離時操作復雜，耗時長，且危險性高、分離的成功率不高；而在免疫學檢驗中又容易出現假陽性，靈敏度不高，因此這兩種方法均不能滿足快速、準確檢疫的要求。較之以上兩種常規檢疫方法，分子生物學檢驗方法具有特異性好、簡單快速等優點。常規的分子生物學檢驗方法有聚合酶聯反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)，實時熒光定量核酸擴增反應(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction，qPCR)，以及環介導等溫擴增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)。qPCR，和LAMP方法較PCR方法靈敏度高，特異性好，因此在低濃度的病原菌檢測上更有優勢。在過去20年中，qPCR已經成為許多病原微生物核酸診斷和定量檢測的標準。盡管如此，qPCR仍有其不可忽視的局限性。閾值(Ct)的設定不可避免地引入了人為主觀因素，且絕對定量依賴于標準曲線，但標準樣品與實驗樣品的來源不同，擴增效率也不同，導致標準曲線的準確度不夠。因此，即便是使用相同商品化的試劑盒以及實驗流程，不同實驗室之間得出的結論可能會相差很大，尤其是當起始模板量較低時，較低的陽性信號與背景信號不易區分，使qPCR的精確度降低。因此，qPCR技術的準確性與重復性仍然不能很好地滿足分子生物學定量分析的要求。qPCR的局限性在于高通量的樣品分析較為困難，花費大而且有一定的時間約束。