[發(fā)明專利]確定多肽二硫鍵位置的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010720190.X
• 申請(qǐng)日: 2020-07-23
• 公開（公告）號(hào): CN111781288A
• 公開（公告）日: 2020-10-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳佩澤;李明;李紅梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/72;G01N30/06;G01N30/88
• 代理公司: 北京鼎真知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11815
• 代理人: 張濯非

本發(fā)明公開了確定多肽二硫鍵位置的方法，該方法包括：將多肽樣本進(jìn)行第一液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，以便得到第一液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果；將所述多肽樣本與還原劑和有機(jī)酸溶液混合，在第一預(yù)定時(shí)間得到部分還原產(chǎn)物，在第二預(yù)定時(shí)間得到完全還原產(chǎn)物；將所述部分還原產(chǎn)物進(jìn)行第二液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，以便得到第二液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果；將所述完全還原產(chǎn)物進(jìn)行第三液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，以便得到第三液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果；基于所述第一液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果、所述第二液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果和所述第三液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果確定所述多肽二硫鍵位置。該方法無(wú)需烷基化，定位方法簡(jiǎn)單、快速、綠色，易操作。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及確定多肽二硫鍵位置的方法。

背景技術(shù)

二硫鍵是由多肽鏈內(nèi)或鏈間的兩個(gè)半胱氨酸側(cè)鏈巰基(-SH)共價(jià)交聯(lián)所形成的一種非常重要的翻譯后修飾。在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中，越來(lái)越多的蛋白質(zhì)或多肽作為生物制劑或疫苗用來(lái)治療各種各樣的疾病。這些生物制劑包含包括激素類、生長(zhǎng)因子、和單克隆抗體等，這些生物分子大多含有二硫鍵。含二硫鍵的藥物在合成中容易發(fā)生二硫鍵的交換和重排，這些副反應(yīng)可導(dǎo)致非原生二硫鍵的形成、蛋白質(zhì)的聚集進(jìn)而可能誘發(fā)免疫原性，使藥物失活。因此，對(duì)多肽和蛋白質(zhì)類藥物中的二硫鍵的定位和分析成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究重點(diǎn)之一。全球肽類和蛋白類藥物發(fā)展迅速，二硫鍵的表征已成為生物制藥安全性和有效性質(zhì)量審評(píng)中不可或缺的重要環(huán)節(jié)。

對(duì)于二硫鍵的定位方法主要包括X射線衍射晶體法(X-ray crystallography)、核磁共振波譜法(NMR)、Edman降解法、質(zhì)譜法。X射線衍射晶體法利用蛋白質(zhì)晶體衍射圖中的二硫鍵間連續(xù)的電子密度情況實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)中的二硫鍵定位。核磁共振波譜法依據(jù)形成二硫鍵的兩半胱氨酸間的H_a和H_β在空間上因二硫鍵的存在而產(chǎn)生NOE相互作用。上述這兩種方法可在分子水平上提供二硫鍵的信息，但對(duì)樣品量要求很大，并且對(duì)樣品純度要求很高。另外，X射線衍射晶體還依賴于高度有序的蛋白結(jié)晶。Edman降解則無(wú)法直接對(duì)含有鏈內(nèi)二硫鍵和N端被封閉的多肽和蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)序。

由此，確定二硫鍵位置的方法有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種確定多肽二硫鍵位置的方法，無(wú)需烷基化，定位方法簡(jiǎn)單、快速、綠色，易操作，對(duì)人體的危害小。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種確定多肽二硫鍵位置的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括：將多肽樣本進(jìn)行第一液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，以便得到第一液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果；將所述多肽樣本與還原劑和有機(jī)酸溶液混合，在第一預(yù)定時(shí)間得到部分還原產(chǎn)物，在第二預(yù)定時(shí)間得到完全還原產(chǎn)物；將所述部分還原產(chǎn)物進(jìn)行第二液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，以便得到第二液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果；將所述完全還原產(chǎn)物進(jìn)行第三液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，以便得到第三液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果；基于所述第一液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果、所述第二液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果和所述第三液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果確定所述多肽二硫鍵位置。

根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的確定多肽二硫鍵位置的方法，通過(guò)在還原過(guò)程中添加了有機(jī)酸達(dá)到無(wú)需進(jìn)行烷基化處理的目的以及通過(guò)對(duì)于質(zhì)譜數(shù)據(jù)新的處理方式，使得方法解析難度較小，無(wú)需完全還原反應(yīng)，避免了使用高毒性的二硫蘇糖醇(DTT)直接完全還原，綠色環(huán)保，顯著降低了人體危害性，簡(jiǎn)化流程，降低成本，操作簡(jiǎn)單快捷。并且，在定位待測(cè)樣品中二硫鍵的同時(shí)能獲得錯(cuò)配體中的二硫鍵的信息，填補(bǔ)了對(duì)于多肽錯(cuò)配體中二硫鍵信息表征的空白。

另外，根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例的確定多肽二硫鍵位置的方法還可以具有如下附加的技術(shù)特征：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述多肽樣本的濃度為80-120μg/g，優(yōu)選地，為100μg/g。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述還原劑為三(2-羧乙基)膦。