[發(fā)明專利]稀有鮔鯽運甲狀腺素蛋白基因、蛋白序列及其應用

有效

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• 申請日: 2020-07-22
• 公開（公告）號: CN111875692B
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發(fā)明（設計）人: 楊先海;趙嵩山;李晶;劉會會
• 申請（專利權）人: 南京理工大學
• 主分類號: C07K14/46
• 分類號: C07K14/46;C12N15/12;C12N15/10
• 代理公司: 南京理工大學專利中心 32203
• 代理人: 劉海霞

本發(fā)明公開了一種稀有鮔鯽運甲狀腺素蛋白基因、蛋白序列及其應用。本發(fā)明通過直接克隆技術，從稀有鮔鯽肝臟中克隆獲得了稀有鮔鯽運甲狀腺素蛋白基因cDNA序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其編碼的運甲狀腺素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本發(fā)明的稀有鮔鯽運甲狀腺素蛋白可用于篩選水中對水生生物產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾的化學物質，以及研究水中化學物質對于生物體的干擾機制。

技術領域

本發(fā)明屬于基因工程技術領域，涉及一種稀有鮔鯽運甲狀腺素蛋白（TTR）基因、蛋白序列及其應用。

背景技術

在脊椎動物中，魚類占主要比例，其分布幾乎涵蓋了所有水生生態(tài)系統(tǒng)。硬骨魚類占脊椎動物物種的一半以上，并適應各種海洋和淡水環(huán)境。由于許多物種在水生食物鏈中位居前列，魚類可能通過食用而直接影響人類健康。因此，魚類通常用于體內(nèi)測試。國際標準化組織（ISO）已推薦斑馬魚、黑頭呆魚、虹鱒魚和青蒿作為水生試驗物種。由于物種差異性和許多潛在的污染物可能直接釋放到中國的生態(tài)系統(tǒng)中，因此有必要使用中國本土物種開展體內(nèi)篩選試驗以進行化學安全性評估。

稀有鮔鯽（Gobiocypris rarus）是一種小型的鯉科魚類，全長30~80 mm，主要分布在四川省長江上游水域。它們的特點是生命周期短，適應溫度范圍廣，易人工培養(yǎng)。與ISO推薦的毒性材料實驗魚斑馬魚相比，稀有鮔鯽的胚胎發(fā)育時間更短，更有利于胚胎學研究。2014年，《GB/T 29763-2013 化學品-稀有鮔鯽急性毒性試驗》首次把稀有鮔鯽作為中國的標準模式生物。因此，作為水生毒理學新興模型的稀有鮔鯽在未來會更廣泛地用于化學安全評估和環(huán)境毒理學研究。

甲狀腺激素（THs）包括甲狀腺素（T₄）和三碘-L-甲狀腺素（T₃），它們在維持脊椎動物穩(wěn)定的生理狀態(tài)中起著至關重要的作用。在脊椎動物中，組織和生物功能的大多數(shù)活動受THs的影響。THs與多種功能有關，如繁殖和行為，發(fā)育和生長，代謝等。在魚類中，運甲狀腺素蛋白（TTR）是關鍵的THs載體蛋白。然而，已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)水體中化學物質的暴露會使得甲狀腺激素的合成，轉運，相互作用受到影響。因此有必要研究水體中存在的化學物質與TTR的相互作用，從而判斷該化學物質對于水生生物內(nèi)分泌系統(tǒng)的干擾。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明通過直接克隆技術，從稀有鮔鯽肝臟中克隆獲得了稀有鮔鯽TTR基因cDNA序列，并對其進行氨基酸理化性質分析、信號肽預測、一級、二級、三級結構預測和同源性分析。最后對其進行表達純化，并應用于篩選水體中存在的內(nèi)分泌干擾物。

本發(fā)明提供稀有鮔鯽運甲狀腺素蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。稀有鮔鯽運甲狀腺素蛋白基因的克隆方法，包括以下步驟：（1）稀有鮔鯽總RNA的提取；（2）cDNA的反轉錄合成；（3）運甲狀腺素蛋白基因的PCR擴增；（4）瓊脂糖凝膠電泳檢測；（5）運甲狀腺素蛋白基因的回收與鑒定；（6）運甲狀腺素蛋白基因的克隆與鑒定；（7）測序；其中步驟（3）PCR擴增以及步驟（7）測序引物的正向引物如SEQ ID NO:3所示，反向引物如SEQ ID NO:4所示，其序列信息如下：

SEQ ID NO:3：5'-ATGGCTAAAGCAGTGATTTGTGT-3'，

SEQ ID NO:4：5'-TCACTCGTGTGCTTTGACGAC-3'。

本發(fā)明還提供分離出的稀有鮔鯽運甲狀腺素蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

進一步地，本發(fā)明提供上述稀有鮔鯽運甲狀腺素蛋白在篩選水中對水生生物產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾的化學物質中的應用。

在本發(fā)明的具體實施方式中，所述的化學物質為2,4,6-三溴苯酚、2,4,6-三碘苯酚、3,5-二氯水楊酸、3-溴-5-氯水楊酸、3,5-二溴-4-羥基苯甲酸或2,3,5-三碘苯甲酸。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：