[發明專利]多殺菌素半抗原、人工抗原和抗體及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202010697076.X
• 申請日: 2020-07-20
• 公開（公告）號: CN111875652A
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 萬宇平;王兆芹;馮月君;王琳琛;徐念琴;張坤;楊春艷;張彩麗
• 申請（專利權）人: 北京勤邦生物技術有限公司;北京望爾生物技術有限公司
• 主分類號: C07H17/08
• 分類號: C07H17/08;C07H1/00;C07H1/06;C07K14/765;C07K14/77;C07K14/795;C07K1/107;C07K16/44;G01N33/53
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本發明公開了多殺菌素半抗原、人工抗原和抗體及其制備方法和應用，本發明提供的多殺菌素半抗原既最大程度保留了多殺菌素的特征結構，使得多殺菌素半抗原的免疫原性明顯增強，又具有可以與載體蛋白發生偶聯的羧基；用多殺菌素半抗原與載體蛋白偶聯后得到的多殺菌素人工抗原去免疫動物，更有利于刺激動物免疫應答產生特異性更強、靈敏度更高的抗體，經檢測多殺菌素抗體的靈敏度可達1μg/L，與其他大環內酯類殺蟲劑的交叉反應率低，為后續建立多殺菌素的各種免疫分析方法提供了基礎。

技術領域

本發明屬于食品安全檢測領域。更具體地，本發明涉及多殺菌素半抗原、人工抗原和抗體及其制備方法和應用。

背景技術

多殺菌素是刺糖多孢菌有氧發酵產生的次級代謝產物，其活性成分為多殺菌素A和多殺菌素D，統稱為多殺菌素(spinosad)。因其具有殺蟲譜廣、殺蟲活性高、對非靶標動物安全、分解產物安全等特點，已廣泛用于棉花等超過150種作物上的鱗翅目和雙翅目以及葉蟬、蜘蛛螨、跳蚤和虱子等害蟲防治，尤其對鱗翅目害蟲的防治效果好。但其殘留超標仍然可能會影響食品安全以及環境安全，因此我國國家標準GB 2763-2019《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》中規定了不同食品中多殺菌素的殘留限量。

目前，國內外檢測多殺菌素主要采用氣相色譜法、氣相色譜-質譜法和液相色譜串聯質譜法等分析方法，存在樣品前處理繁瑣、檢測時間長、儀器貴重等缺點，所以在我國無法得到廣泛應用，并且不符合現場檢測“在短時間內低成本對大量樣品進行準確檢測和篩選”的要求。而免疫學檢測分析技術以其高靈敏、特異性高、快速、操作簡便等優點在藥物殘留檢測領域已被廣泛應用，比起儀器等檢驗方法有很多優勢。所以免疫分析為多殺菌素殘留研究提供了一條新的分析檢測方法。

在建立免疫學檢測方法并應用該檢測方法檢測多殺菌素殘留量時，關鍵技術在于能夠獲取到特異性強、靈敏度高的抗體，而要實現這一目標，前提條件就是得合成、制備出合適的多殺菌素半抗原。有研究發現，多殺菌素的大環內酯四環是其特征結構，對免疫反應起著非常重要的作用。而發明專利CN106967140A采用將多殺菌素大環內酯環上連接的福莫胺糖替換為帶-COOH的間隔臂，進而與載體蛋白偶聯，這樣修飾位點與多殺菌素分子的特征結構距離較近，不利于半抗原分子特征結構的暴露，使得動物的免疫系統對半抗原分子特征結構的識別難度加大，抗體的親和性和特異性降低。因此，要制備高特異性的抗體，多殺菌素分子中的修飾位點應遠離其特征結構大環內酯環，使半抗原的特征分子結構部分得以充分暴露，同時避免載體蛋白對半抗原分子特征結構的屏蔽作用。

發明內容

針對現有技術中存在的不足之處，本發明提供一種能最大程度保留多殺菌素的特征結構，又具有一定長度連接臂的半抗原以及這種半抗原的制備方法；以此半抗原制備的人工抗原、檢測靈敏度高和特異性強的抗體；以及此半抗原的應用。

為了實現本發明的目的，第一方面，本發明提供一種多殺菌素半抗原，其具有如下結構式：

本發明提供的多殺菌素半抗原在多殺菌素的分子結構上引入羧基活性基團，從而可以與載體蛋白進行偶聯得到人工抗原用于免疫；該多殺菌素半抗原保留了多殺菌素的所有特征基團，最小改變多殺菌素原有結構特征，同時與載體蛋白偶聯后，突出的是多殺菌素本身獨有的十二元內酯環部分的結構，為后續刺激動物免疫應答產生特異性更強、靈敏度更高的抗體奠定基礎。

第二方面，本發明提供上述多殺菌素半抗原的制備方法，其包括如下步驟：

1)在過氧化物作用下，多殺菌素與溴化氫發生加成反應，得到溴代多殺菌素，所述溴代多殺菌素具有結構式

2)在堿性條件下，溴代多殺菌素與氨基丁酸發生親核取代反應，得到多殺菌素半抗原。

進一步地，上述步驟1)中，所述過氧化物為間氯過氧苯甲酸；

所述反應在溶劑中進行，所述溶劑為無水四氯化碳；