[發明專利]一種sgRNA及其應用

在審

• 申請號: 202010694519.X
• 申請日: 2020-07-17
• 公開（公告）號: CN111849983A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 劉劍鋒;胡蒸蒸;余健;杜恒
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;C12N5/10;C40B40/02;C40B50/06
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 商秀玲

1.一種sgRNA，其能夠識別豬全基因組的靶基因之一，所述靶基因為蛋白編碼基因或miRNA；所述靶基因含有PAM位點，所述PAM位點為NGG，N為任意堿基；

當所述靶基因為蛋白編碼基因時，所述sgRNA的靶序列為所述靶基因的不同轉錄本的CDS的交集序列；若所述靶基因的不同轉錄本的CDS沒有交集，所述sgRNA的靶序列為所述靶基因的核苷酸序列最長的轉錄本；

當所述靶基因為miRNA時，所述sgRNA的靶序列為miRNA前體序列或成熟序列；

所述sgRNA還具有以下結構：

(1)所述sgRNA的核苷酸序列包含X-NGG結構，其中，X包含與所述靶序列互補的核苷酸序列，X的長度為20bp；所述sgRNA的核苷酸序列中的NGG與所述靶基因的PAM位點一致；

(2)所述sgRNA的核苷酸序列中，G和C的總含量為45-70％；

(3)所述sgRNA的核苷酸序列中不含有4個以上連續排列的T。

2.一種表達載體，其包括與至少一個表達控制序列可操作地連接的編碼權利要求1所述的sgRNA的DNA片段。

3.根據權利要求2所述的表達載體，其是病毒、真菌或細菌表達載體。

4.一種載體文庫，其包括多個權利要求2或3所述的表達載體。

5.根據權利要求4所述的載體文庫，其中，針對每個所述靶基因，包含4-6個特異性表達載體，每個所述特異性表達載體含有不同的所述sgRNA的DNA片段。

6.根據權利要求5所述的載體文庫，其分為A庫和B庫，針對同一個所述靶基因，每個庫中均具有2-3個所述特異性表達載體。

7.根據權利要求4-6任一項所述的載體文庫，其還包括陰性對照載體，所述陰性對照載體對所述豬全基因組的任意基因均不具有識別功能。

8.根據權利要求4-7任一項所述的載體文庫，其可識別≥96％的所述豬全基因組的靶基因。

9.一種豬細胞文庫，其包含以權利要求4-8任一項所述的載體文庫敲除真核基因后的豬細胞。

10.根據權利要求9所述的豬細胞文庫，其構建方法如下：

構建可穩定表達Cas9蛋白的豬細胞系；以及

以所述載體文庫中的表達載體侵染所述豬細胞系，所述表達載體為慢病毒表達載體。