[發明專利]用于制備4-雄甾烯-3,17-二酮（4-AD）的HGMS2菌株突變體

在審

• 申請號: 202010694128.8
• 申請日: 2020-07-17
• 公開（公告）號: CN111733122A
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發明（設計）人: 蘇正定;成細瑤;周曦
• 申請（專利權）人: 武漢艾默佳華生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12P33/00;C12P33/16;C12P33/02;C12R1/32
• 代理公司: 北京久維律師事務所 11582
• 代理人: 杜權

本申請提供了用于制備4?雄甾烯?3,17?二酮(4?AD)的HGMS2菌株突變體。HGMS2菌株突變體的KstD和Ksh基因被敲除。本申請的敲除KstD和Ksh基因的HGMS2菌株與野生型HGMS2菌株相比，敲除型菌株顯著降低了ADD和9?OH?AD的產生。此外，在發酵中敲除KshA和KstD基因的突變菌株，提高了4?AD產量，減少了雜質。

技術領域

本申請涉及生物領域，具體地，涉及用于制備4-雄甾烯-3,17-二酮(4-AD)的HGMS2菌株突變體。

背景技術

類固醇起抗菌、消炎、抗病毒和抗癌治療的作用，類固醇的核心結構通常由三個六元環己烷環和一個五元環戊烷環組成。高級甾體藥物的合成依賴于最重要的起始原料4-雄甾烯-3,17-二酮(4-AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)。4-AD的生產更為重要，因為后者可以由4-AD合成。

目前，4-AD是由含有不完全甾體降解途徑的細菌對植物甾醇進行生物轉化而產生的環境友好型物質(使用具有不完整類固醇降解途徑的細菌通過植物甾醇的生物轉化以環境友好的方式生產4-AD)。盡管許多放線菌都含有類固醇降解途徑，包括假單胞菌NCIB10590和單形諾卡氏菌VKM Ac-2033D，但是只有分枝桿菌屬的菌株才適合工業應用。從自然界中分離出來的分枝桿菌NRRL B-3805是第一種用于將植物甾醇工業規模轉化為4-AD的細菌。隨后還分離出了用于工業應用的其他分枝桿菌菌株，例如分枝桿菌NwIB-01和分枝桿菌HGMS2。到目前為止，所有這些菌株都屬于新金分枝桿菌組。然而，這些菌株在植物甾醇轉化過程中產生多個4-AD類似物，使得4-AD產量的提高及其在工業中的純化遇到困難。

在過去的十年中，細菌類固醇降解途徑的分子機制的揭示得益于關鍵酶的生化特性、基因簇的識別以及對分解類固醇的不同細菌的基因組注釋的綜合信息。總的來說，9,10-開環甾類化合物的形成是一個核心通路，并進一步擴展為三條通路，即膽固醇降解途徑、膽酸降解途徑和睪丸激素降解途徑。調控細菌降解植物甾醇涉及的基因多達260個。用于植物甾醇生物轉化的工業微生物主要利用膽固醇降解途徑來氧化3-羥基并降解植物甾醇的側鏈，然后積累類固醇中間體。M.NRRL B-3805在不完全降解4-AD的情況下，使用11種酶連續14個步驟分解植物甾醇。恥垢分枝桿菌有一個與膽固醇降解途徑不同的額外基因簇，用于C和D甾體環的代謝。紅球菌RHA1菌株的膽固醇降解途徑對ADD和3,4-DHSA的降解表現出更強的活性。新金黃色葡萄球菌ATCC 25795中的膽固醇降解途徑使用羥類固醇脫氫酶(Hsd4A)作為分子開關，以區分兩種競爭性分支途徑，即固醇側鏈降解的AD和HBC子途徑。

在細菌的膽固醇降解途徑中，兩個最重要的關鍵酶3-甾酮-1，2脫氫酶(KstD)和3-甾酮-9α-羥化酶(Ksh)在C9,10位引起B環斷裂。KstD是一種黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依賴性酶，可在3-酮類固醇底物A環的C1和C2原子之間的位置引入雙鍵。在NCBI蛋白質數據庫中的一項搜索顯示，超過500種不同的微生物含有推測的KstD酶基因，主要在放線菌門屬中。重要的是，單個物種可能包含多個底物特異性的KstD。例如，紅球菌菌株有三種不同的KstD基因。新金分枝桿菌DSM 1381也含有三種不同的KstD酶基因，而Gordonia neofelifaecisNRRL B-59395含有多達五個KstD酶基因。每個菌種每個KstD酶在氨基酸序列和三維構象方面均表現出獨特性。

盡管已采用傳統的UV或者化學介導的突變策略和現代代謝工程技術來提高4-AD和其他固醇化合物的生產率，但由于植物甾醇降解途徑的復雜性，相關進展并不顯著。

發明內容

為了解決上述問題，本申請提供了一種用于制備4-雄甾烯-3,17-二酮(4-AD)的HGMS2菌株突變體，其中，所述HGMS2菌株突變體的KstD和Ksh基因被敲除。