[發(fā)明專利]雙特異性T細(xì)胞激動劑CD3-FAP/nanoBiTE，其制備及在抗腫瘤中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010693659.5
• 申請日: 2020-07-17
• 公開（公告）號: CN113943739B
• 公開（公告）日: 2023-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盧小玲;謝深霞;施維;楊曉梅;李翠
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12N15/13
• 分類號: C12N15/13;C07K16/46;C12N15/70;A61K39/395;A61P35/00
• 代理公司: 北京格允知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11609
• 代理人: 譚輝

本發(fā)明涉及包含雙特異性T細(xì)胞激動劑CD3?FAP/nanoBiTE的多肽，編碼該多肽的多核苷酸，所述多肽和多核苷酸的制備方法，及其應(yīng)用。所述雙特異性T細(xì)胞激動劑CD3?FAP/nanoBiTE是基于納米抗體的新型雙特異性T細(xì)胞激動劑(bispecific?T?cell?engager，BiTE)?CD3?FAP/nanoBiTE，其誘導(dǎo)T細(xì)胞靶向腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，為BiTE的腫瘤細(xì)胞免疫靶向治療提供一種新的策略。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于治療腫瘤的生物材料，尤其涉及一種雙特異性T細(xì)胞激動劑，該雙特異性T細(xì)胞激動劑的制備方法，及該激動劑在抗腫瘤中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

BiTE(bispecific?T?cell?engager)是運(yùn)用單鏈抗體技術(shù)將兩個(gè)不同抗體的輕重鏈可變區(qū)通過一條多肽鏈連接的雙特異性抗體，能夠有效激活效應(yīng)細(xì)胞T細(xì)胞，精確地引導(dǎo)T細(xì)胞特異性的殺傷靶細(xì)胞。BiTE與其它雙特異性抗體相比，最大的不同點(diǎn)在于它的結(jié)構(gòu)，它采用單鏈抗體技術(shù)將兩個(gè)不同抗體的可變區(qū)通過一條短肽連接在一起。與傳統(tǒng)抗體相比，它缺少Fc段，分子量較小，免疫原性較低，組織穿透力強(qiáng)。BiTE使T細(xì)胞和靶細(xì)胞連接在一起，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。但對于具體的靶向T細(xì)胞的抗體、具體的靶向腫瘤細(xì)胞的抗體、以及連接二者的連接肽的選擇，對所得BiTE雙特異性抗體的表達(dá)量和生物活性影響很大。

成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP)是腫瘤基質(zhì)中活化成纖維細(xì)胞表達(dá)的一種表面抗原，在活化的成纖維細(xì)胞中含量豐富，可以激活腫瘤基質(zhì)中的生長因子等，有利于血管生成，從而促進(jìn)腫瘤生長。成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP)在腫瘤的發(fā)生，發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)，F(xiàn)AP作為一種理想的抗腫瘤靶分子，在90％以上的惡性腫瘤活化成纖維細(xì)胞表面都有表達(dá)，F(xiàn)AP靶位豐富，局部濃度高且無個(gè)體差異性，在腫瘤的免疫治療中應(yīng)用前景廣闊。

在前期科學(xué)研究中，為優(yōu)化BiTE的水溶性，穩(wěn)定性及提高生產(chǎn)表達(dá)量以提高功能效應(yīng)，前人已經(jīng)做過大量探索，然而運(yùn)用納米抗體構(gòu)建BiTE還未見有報(bào)道。更沒有人研究探索對兩種具體納米抗體以及連接肽的選擇。

因此，本發(fā)明構(gòu)建了同時(shí)靶向FAP和CD3的納米抗體的新型雙特異性T細(xì)胞激動劑CD3-FAP/nanoBiTE，探索其連接序列，以改善傳統(tǒng)BiTE的水溶性、穩(wěn)定性和組織穿透力，提高表達(dá)產(chǎn)量，以提高T細(xì)胞在腫瘤局部的富集程度，從而進(jìn)一步提高抗腫瘤效果，從而為BiTE的腫瘤細(xì)胞免疫靶向治療提供新的策略。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：

在第一方面，本發(fā)明提供了一種編碼雙特異性T細(xì)胞激動劑CD3-FAP/nanoBiTE的多核苷酸，所述多核苷酸包含通過(Gly4Ser)3連接肽編碼序列連接在一起的CD3納米抗體的基因序列與FAP納米抗體的基因序列。

在第一方面所述的編碼雙特異性T細(xì)胞激動劑CD3-FAP/nanoBiTE的多核苷酸中，所述多核苷酸的序列為SEQ?ID?No.2。

在第二方面，本發(fā)明提供了一種包含雙特異性T細(xì)胞激動劑CD3-FAP/nanoBiTE的多肽，多肽包含連接肽連接在一起的CD3納米抗體與FAP納米抗體。

在第二方面所述的包含雙特異性T細(xì)胞激動劑CD3-FAP/nanoBiTE的多肽中，所述多肽的氨基酸序列為SEQ?ID?No.1。

在第三方面，本發(fā)明提供了一種制備雙特異性T細(xì)胞激動劑CD3-FAP/nanoBiTE的方法，所述制備方法包括如下步驟：

(1)獲得一對引物，其中：上游引物為：5′-CGCGGATCCATGGGCACTGCTACCGTTGAG-3′，引入酶切位點(diǎn)KpnI；下游引物為5′-CCAAGCTGGTACAAGAGCTGCTTTGCTTGTG-3′，引入酶切位點(diǎn)HindⅢ；

(2)利用所述一對引物，以重組質(zhì)粒PUC57-CD3-FAP/nanoBiTE為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；