[發明專利]辣椒脈斑駁病毒多基因聯合檢測鑒定方法

在審

• 申請號: 202010681921.4
• 申請日: 2020-07-15
• 公開（公告）號: CN111808992A
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發明（設計）人: 高芳鑾;沈建國;蔡偉;楊宏凱;陳細紅;楊晶文
• 申請（專利權）人: 福建農林大學;福州海關技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學俊

本發明提供辣椒脈斑駁病毒多基因聯合檢測鑒定方法，屬于植物病毒檢測領域，其采用了兩個引物對CP337?F/CP337?R、CI655?F/CI655?R，建立基于ChiVMV外殼蛋白（CP）與細胞質內含體（CI）兩個基因的多基因聯合檢測體系。該方法不僅具有良好的特異性，而且靈敏度與單一RT?PCR的靈敏度相當，均為10^?4數量級，顯示出良好的檢測靈敏度。本發明建立的多基因聯合檢測體系能在一個反應中同時檢測出ChiVMV的CP及CI基因保守區片段，可以滿足口岸進出境和農業生產上辣椒脈斑駁病毒的快速、準確檢測需求。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及辣椒脈斑駁病毒多基因聯合檢測鑒定方法。

背景技術

辣椒（Capsicum annuum L.）是茄科辣椒屬一年或有限多年生草本植物，原產于中南美洲熱帶地區，在世界范圍內廣泛種植。在我國，辣椒種植面積高達140 hm²以上，約占我國所有蔬菜種植面積的10%。病毒病是辣椒作物上的一類重要病害，嚴重影響辣椒作物的品質和產量，目前世界各地陸續報道的辣椒病毒有70種以上，而我國發現至少有37種，其中辣椒脈斑駁病毒（Chilli veinal mottle virus, ChiVMV）是辣椒上重要病毒之一，其傳播速度快且危害大，侵染辣椒能造成嚴重的經濟損失。ChiVMV是一種正義單鏈RNA病毒，屬馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）成員，其基因組全長約9711個核苷酸，粒體形態呈彎曲線狀。該病毒最早是1979年于馬來西亞被報道，在我國最早發現于海南的黃燈籠椒上，隨后在陜西、云南、福建、湖南等地區被發現并報道。ChiVMV侵染辣椒的典型癥狀為葉脈呈暗綠色條紋，葉片皺縮、畸形，植株矮小，結果前落花落果，僅留下少量雜色畸形果。該病毒的自然寄主主要為辣椒、番茄等茄科作物，自然條件下主要依靠蚜蟲進行非持久性傳播。除此之外，ChiVMV還可以通過機械傳播和汁液傳播，但不能通過種子傳播。由于該病毒常與其他病毒復合侵染，且不同病毒侵染后癥狀也較為相似，因此建立一種可靠、高效的檢測鑒定方法顯得尤為重要。

近年來，國內外關于ChiVMV的研究報道越來越多，且已有多種成熟的技術用于該病毒的檢測與鑒定，如Ravi等利用電鏡對提純后的病毒進行觀察首次報道了該病毒粒體形態；Siriwong等通過對該病毒泰國分離物的血清學研究，發現其與ChiVMV分離物抗血清存在強烈的陽性反應；Moury 等根據不同辣椒病毒的核內含體蛋白b（Nuclear inclusionbody protein,NIb）及外殼蛋白（Coat protein, CP）基因序列相互比較并設計引物，通過RT-PCR的特異性片段區分了ChiVMV與其他辣椒病毒；唐前君等通過建立能夠同時檢測包含ChiVMV等4種辣椒病毒的四重RT-PCR檢測體系，提高了辣椒病毒病復合侵染的檢測效率；湯亞飛等^]依據CP基因設計了能檢測ChiVMV的RT-LAMP引物，建立了ChiVMV的RT-LAMP檢測體系，后又利用小RNA深度測序及RT-PCR的方法鑒定了包括ChiVMV在內侵染廣東省辣椒的8種病毒。由于Potyvirus的不同病毒之間可能存在非常高的親緣關系，無法實現ChiVMV的快速、準確檢測與鑒定。例如ChiVMV與甜椒脈斑駁病毒 （Pepper veinal mottle virus,PVMV）之間在系統發育上親緣關系非常近，且兩者CP基因的C末端有一段長204個氨基酸的保守區，序列一致性超過90.2%，應用傳統的血清學容易產生交叉反應。因此生產上建立一種基于多基因聯合快速、準確檢測ChiVMV的方法尤為迫切。