[發明專利]一種艱難梭菌抗原及多克隆抗體的制備方法和檢測試劑盒

在審

• 申請號: 202010655672.1
• 申請日: 2020-07-09
• 公開（公告）號: CN111763263A
• 公開（公告）日: 2020-10-13
• 發明（設計）人: 徐廣賢;潘俊斐;張愛君;楚元奎;王紅霞;蔣丹;屈煜良;李光琪;李燕寧
• 申請（專利權）人: 寧夏醫科大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K16/12;C07K16/06;G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 代芳

1.一種艱難梭菌抗原，其特征在于，所述抗原包括將抗原表位TcdB1和TcdB2分別與載體蛋白鑰孔血藍蛋白KLH連接形成的抗原；所述TcdB1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述TcdB2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根據權利要求1所述抗原，其特征在于，在所述連接前，還包括分別在所述TcdB1和TcdB2的氨基酸序列的N端添加1個半胱氨酸修飾。

3.一種艱難梭菌的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：每隔兩周對新西蘭兔進行一次免疫，在第5次免疫2周后，從血液中分離純化蛋白，得多克隆抗體Anti-TcdB1或Anti-TcdB2；

第一次免疫時，利用權利要求1或2所述抗原分別單獨與弗氏完全佐劑等體積混勻，乳化后得首次免疫抗原，利用所述的首次免疫抗原免疫兔；

第二次至第四次免疫時，利用權利要求1或2所述抗原分別單獨與弗氏不完全佐劑等體積混勻，乳化后得第二免疫抗原，利用所述第二免疫抗原免疫所述兔；

第五次免疫時，利用權利要求1或2所述抗原免疫所述兔。

4.根據權利要求3所述制備方法，其特征在于，在第一次免疫時，在兔腋下、頸部和背部共5處分別注射所述第一免疫抗原0.1mg；

在第二次至第四次免疫時，在第一次免疫的相同位置分別注射所述第二免疫抗原0.1mg；

在第五次免疫時，經耳緣靜脈注射權利要求1或2所述抗原0.1mg。

5.根據權利要求3或4所述制備方法，其特征在于，在每次免疫后1周還包括采集血清，用間接ELISA方法測定血清抗體效價并進行Western-blot驗證抗體的特異性。

6.根據權利要求3所述制備方法，其特征在于，所述分離純化，包括將心臟血經4000r/min分離血清，用0.45μm濾器過濾后通過proteinA親和層析柱分離純化。

7.一種人艱難梭菌TcdB雙抗體夾心ELISA試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括以下成分：96孔板、PBS緩沖液、PBST緩沖液、包被液、封閉液、抗體稀釋液顯色液、終止液和抗體，所述抗體包括一抗和二抗，所述一抗為利用權利要求3～6任一項所述制備方法制備得到的Anti-TcdB1，所述二抗為HRP標記的利用權利要求3～6任一項所述制備方法制備得到的Anti-TcdB2。

8.根據權利要求7所述試劑盒，其特征在于，利用所述試劑盒檢測人艱難梭菌前，包括對所述96孔板進行預處理，所述預處理包括：利用所述包被液將Anti-TcdB1稀釋至0.5μg/ml，100μl/孔加至96孔板，37℃包被2小時后，轉4℃包被8～12h；包被后用所述PBST緩沖液洗板三次；向包被后的板內每孔加入300μl封閉液，置于37℃封閉2小時后，轉移至4℃繼續封閉8～12h；封閉后用所述PBST緩沖液洗板三次，干燥。

9.根據權利要求8所述試劑盒，其特征在于，所述包被液包括摩爾濃度為0.05M的碳酸鹽緩沖液，pH值為9.6。

10.根據權利要求7所述試劑盒，其特征在于，所述抗體稀釋液為含BSA的PBST緩沖液，所述BSA和PBST的質量體積比為0.2g：100mL。