[發明專利]一種檢測毛竹環狀RNA表觀遺傳修飾的方法

在審

• 申請號: 202010640832.5
• 申請日: 2020-07-06
• 公開（公告）號: CN111705119A
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發明（設計）人: 顧連峰;王慧慧;王永生;韓茜妹;魏文桃;席飛虎;王匯源
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學俊

本發明公開了檢測毛竹環狀RNA表觀遺傳修飾的方法，屬于分子生物學領域。目前常用的RNA修飾檢測方法，一般采用特異性RNA修飾的抗體，進行免疫沉淀，結合高通量測序來識別RNA修飾位點。而使用本方法首先純化得到環狀RNA，將環狀RNA打斷并3'端去磷酸化，基于ONT平臺直接對RNA進行測序，即可獲得環狀RNA的多種表觀修飾信息，如m⁶A、m⁵C，m¹A等。本發明首次提出了避免PCR擴增，直接從單堿基精度上檢測環狀RNA表觀修飾位點的新型方法，克服了傳統方法的繁瑣流程與高額的抗體成本，這不僅豐富了檢測環狀RNA中表觀修飾方法的多樣性，也為探究環狀RNA的結構和功能提供了新的思路。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種檢測毛竹環狀RNA 表觀遺傳修飾的方法。

背景技術

在生物的轉錄過程中，大量mRNA前體可以通過反向剪接產生環狀RNA (circularRNA)。與線性RNA不同，環狀RNA具有共價閉環結構，沒有5' 端帽子和3' 端poly(A) 尾巴。環狀RNA不僅可以通過與線性RNA競爭的方式影響基因的表達，還可以充當microRNA(miRNA) 海綿體，吸附miRNA，調控靶基因的降解；或者與RNA結合蛋白相互作用，調控基因的轉錄。已有研究表明，一些環狀RNA與神經元功能、先天免疫反應及細胞全能性密切相關。環狀RNA還可以充當多種疾病診斷和治療的潛在分子標記物，在人類疾病尤其是在癌癥的發生與發展中起重要作用。此外，已有研究證實，環狀RNA可通過內部核糖體進入位點（IRES）驅動翻譯成蛋白質，如人體中與多聚核糖體相關的circ-ZNF609，包含一個從起始密碼子開始的開放閱讀框，結束于終止密碼子，不依賴于5' 帽子即可翻譯成蛋白質，從而控制成肌細胞的增殖。

隨著RNA深度測序技術和生物信息學的發展，環狀RNA的表觀遺傳修飾，引起了越來越多研究者的關注。常見的RNA修飾包括6-甲基腺苷（6-methyladenosine, m⁶A）、假尿苷（pseudouridine）、5-甲基胞苷（5-methylcytidine, m⁵C）、2'- O-核糖甲基化（2′-O-ribosemethylation）和1-甲基腺苷（1-methyladenosine, m¹A），這些修飾在很大程度上豐富了RNA的遺傳與功能多樣性。目前研究較多的是m⁶A修飾。作為最豐富的堿基修飾方式，m⁶A參與調控RNA的許多功能，在分子層面，m⁶A修飾主要參與調節RNA-蛋白質相互作用、RNA二級結構穩定性、RNA剪接及翻譯調控，進而影響許多生理病理過程，如肥胖、胚胎發育、神經突觸信號傳遞、腫瘤、精子發育等。已有研究證實，在環狀RNA中存在保守的m⁶A基序和甲基化修飾位點，可調控環狀RNA的翻譯。此外，m⁶A修飾的環狀RNA通過與YTHDF1 / YTHDF2蛋白相互作用可以調節mRNA的穩定性。由于檢測技術的局限性，現有方法只能檢測環狀RNA中單一類別的修飾位點，很難從整體水平上揭示環狀RNA表觀遺傳修飾的全局分布情況。例如，基于m⁶A抗體免疫沉淀，結合高通量測序技術（m⁶A-seq或MeRIP）鑒定RNA上m⁶A的修飾位點、應用m⁵C RNA免疫沉淀深度測序技術（m⁵C RNA immunoprecipitation sequencing, m⁵CRIP-seq）鑒定轉錄水平m⁵C修飾位點等。