[發(fā)明專利]適用于微量細(xì)胞的RIP實驗的建庫測序方法

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• 申請日: 2020-07-06
• 公開（公告）號: CN111826419A
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 尹杰
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶生命知源科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6804
• 分類號: C12Q1/6804;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京元本知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11308
• 代理人: 黎昌莉

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于適用于微量細(xì)胞的RIP實驗的建庫測序方法。該方法具體為對RIP實驗的結(jié)果進(jìn)行測定并分類，然后根據(jù)不同的值進(jìn)行不同的建庫測序。該方法適用于微量細(xì)胞，解決了DNA與蛋白，蛋白與蛋白的項目結(jié)合導(dǎo)致后續(xù)難以去除DNA從而干擾分析數(shù)據(jù)的問題，而且不需要使用超聲打斷法將DNA進(jìn)行片段化，即不會影響RNA與蛋白的結(jié)合效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于適用于微量細(xì)胞的RIP實驗的建庫測序方法。

背景技術(shù)

生物的基因調(diào)控和表達(dá)是極其復(fù)雜但有序的過程，RNA，尤其是非編碼RNA，之前被認(rèn)為是一種不具備生物學(xué)功能的物質(zhì)，近年來被證實參與了多種生物學(xué)調(diào)控過程。其中，RNA與蛋白相互作用，可以結(jié)合在基因啟動子區(qū)，進(jìn)而調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

RNA免疫共沉淀技術(shù)(RNA Immunoprecipitation,RIP)是研究RNA-蛋白質(zhì)在體內(nèi)相互作用的標(biāo)準(zhǔn)方法。RNA免疫共沉淀技術(shù)可以定位分析體內(nèi)蛋白質(zhì)與RNA的作用位點，運(yùn)用RIP技術(shù)與其他方法相結(jié)合，例如與高密度芯片(microarray)、測序(sequencing)、northern bolt等技術(shù)相結(jié)合可以獲得整個系統(tǒng)內(nèi)與某一特定蛋白產(chǎn)生項目作用的RNA序列，通過序列定位，可以進(jìn)一步得出這些RNA的序列在基因組上分分布位置，作用方式，結(jié)合的靶序列等信息。

RIP技術(shù)的一般技術(shù)流程為：首先對細(xì)胞或組織進(jìn)行不同時間的甲醛交聯(lián)，分別裂解細(xì)胞膜及細(xì)胞核，使用超聲方式將染色質(zhì)打碎成一定長度范圍的片段。加入抗體，抗體會特異性地與靶蛋白結(jié)合，而后通過磁珠與抗體的相互作用，將靶蛋白及與其結(jié)合的RNA以及DNA片段富集。解交聯(lián)并消化蛋白后，再用DNA酶將DNA消化，最后將RNA提純，對捕獲的RNA片段逆轉(zhuǎn)錄建庫，進(jìn)行第二代測序。根據(jù)數(shù)據(jù)片段在基因組上的富集情況，進(jìn)而獲得全基因組水平的特定蛋白與RNA相互作用的圖譜。

然而，現(xiàn)有的RIP-seq技術(shù)主要存在如下問題：建庫效率低，不適用于少量細(xì)胞實驗；交聯(lián)后除了RNA與蛋白相互結(jié)合并固定以外，DNA與蛋白，蛋白與蛋白的項目結(jié)合也同樣被固定，在后續(xù)實驗中很難完全去除DNA的影響，導(dǎo)致分析數(shù)據(jù)時很難排除DNA的干擾；交聯(lián)法需要將DNA進(jìn)行片段化，片段化過程中一般適用超聲波破碎打斷，這種方法很容易影響RNA與蛋白的結(jié)合效率，從而倒是獲得的RNA量大受影響。

超聲打斷法是對染色質(zhì)進(jìn)行隨機(jī)打斷，獲得一定長度范圍內(nèi)的片段。因此，在靶蛋白及RNA復(fù)合物的周圍也帶有一些非靶蛋白特異結(jié)合的RNA序列或是其他蛋白結(jié)合的位點。這些非特異性位點在后面建庫測序過程中均會被保存下來，成為靶蛋白圖譜分析的干擾背景，獲得寬峰，降低了檢測結(jié)合位點的分辨率和準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明在于提供一種適用于微量細(xì)胞的RIP實驗的建庫測序方法。

RIP實驗為常規(guī)的RIP實驗，具體包括以下步驟：(1)將細(xì)胞離心獲得細(xì)胞沉淀A；(2)用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗并離心所述細(xì)胞沉淀A得細(xì)胞沉淀B；(3)用所述與細(xì)胞沉淀B等體積的核糖體裂解緩沖液重懸所述細(xì)胞沉淀B，并處理成單細(xì)胞懸液；(4)準(zhǔn)備免疫沉淀用的免疫磁珠以及目標(biāo)蛋白抗體；(5)免疫沉淀反應(yīng)獲得RNA-蛋白結(jié)合的復(fù)合物；(6)對所述RNA-蛋白進(jìn)行處理得RNA。

具體地，步驟(3)后，所述單細(xì)胞懸液-5℃—5℃放置3-8min后，放置于-90℃—-70℃；所述PBS緩沖液的pH＝7.4；所述核糖體裂解緩沖液為：1000mM KCl,50mM MgCl2,100mMHEPES-NaOH pH 7,5％NP-40。10倍濃度儲存液保存于室溫，使用時用水稀釋10倍，并添加1mM二硫蘇糖醇l(DTT),200units/ml RNA酶抑制劑，以及不包含EDTA的蛋白酶抑制劑復(fù)合物；步驟(4)所述的免疫為A蛋白或G蛋白包被的免疫磁珠。