[發明專利]檢測前列腺癌患者外周血循環腫瘤細胞E-Cadherin表達的免疫熒光試劑盒及方法

在審

• 申請號: 202010624672.5
• 申請日: 2020-07-01
• 公開（公告）號: CN111638351A
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發明（設計）人: 李文濤;李琛琛;洪瑛;侯景陽
• 申請（專利權）人: 山東凱歌智能機器有限公司
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N33/574;G01N33/569;B01D29/05
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本發明公開了種檢測前列腺癌患者外周血循環腫瘤細胞E?Cadherin表達的免疫熒光試劑盒及檢測方法，試劑盒包括稀釋液，脫色液，染色液A，染色液B，甲醇、2%PFA，10%山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗E?Cadherin組成的一抗混懸液，熒光標記的羊抗小鼠、熒光標記的羊抗大鼠、熒光標記的羊抗兔組成的二抗混懸液，DAPI封片劑；檢測方法包括外周血采集，膜過濾分離，染色，判斷是否存在CTC，并通過免疫熒光方法檢測外周血CTC的E?Cadherin表達情況。本專利提供的方法，不用穿刺活檢獲取組織標本即可檢測到晚期或復發前列腺癌患者E?Cadherin表達情況，利用微創技術，能夠實現實時動態檢測。

技術領域

本發明提供了一種前列腺癌患者外周血循環腫瘤細胞E-Cadherin表達的免疫熒光試劑盒及檢測方法，屬于分子生物學技術領域。

背景技術

在世界范圍內，前列腺癌發病率居男性惡性腫瘤第2位，癌癥特異性死亡居第6位。2015中國腫瘤登記年報顯示，2011年中國前列腺癌發病率居惡性腫瘤第9位，城市男性前列腺癌的發病率和死亡率在男性惡性腫瘤中分別居第6位和第9位。前列腺癌治療的難點是轉移性前列腺癌，尤其是內分泌治療后出現的去勢抵抗現象，目前轉移性前列腺癌去勢抵抗后的治療手段有限，并且會出現所有的常規治療手段（放療、化療、內分泌治療、靶向治療）都失效的情況。

隨著分子生物學的發展，中晚期前列腺細胞癌的免疫治療逐漸興起，初步的臨床試驗也取得了較好的療效，目前多項III期臨床試驗正在開展，E-鈣粘蛋白(E—Cadherin)是上皮細胞表型最經典的標志物，E-Cadherin表達的下調標志著細胞之間粘附能力的下降，因此E-Cadherin被當做鑒定前列腺癌E-Cadherin發生的主要手段之一，作為一類細胞表面糖蛋白，E-Cadherein在細胞-細胞之間的粘附中發揮重要作用，并參與組織器官的維持。近年來有關于前列腺癌E-Cadherin和腫瘤耐藥之間的關系日益受到重視，大量研究顯示在不同的腫瘤當中由于EMT的發生而同時耐藥性的升高，并且都伴隨著E-Cadherin表達的改變。目前，國內外前列腺癌診治指南均認為：前列腺癌E-Cadherin突變檢測的時間點包括初診時及爭取在疾病進展時再次檢測，應通過重復檢測減少假陽性和假陰性。

循環腫瘤細胞（Circulating tumor cell，CTC）是從實體腫瘤脫落進入外周血液循環的腫瘤細胞，自1989年被發現以來，目前已有多種方法用于外周血循環腫瘤細胞的檢測。近期研究表明，其檢測對于評估腫瘤患者尤其是晚期腫瘤患者的預后以及選擇合適的個體化治療具有重要的臨床意義。因CTC檢測具有微創、實時檢測等特點，被稱為腫瘤的“液態活檢”。

免疫熒光分析技術即將免疫學方法(抗原抗體特異結合)與熒光標記技術結合起來用以研究特異蛋白抗原在細胞內分布的方法。由于熒光素所發出的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，熒光素受激發光的照射而發出明亮的熒光(黃綠色或橘紅色)，可以看見熒光所在的細胞或組織，利用定量技術測定含量，從而對抗原進行細胞定性和定位分析。

針對目前臨床實踐中，前列腺癌患者E-Cadherin檢測的標本主要為腫瘤組織，來源于手術或穿刺活檢，很難做到多次或實時檢測。因此，檢測循環腫瘤細胞(CTC)E-Cadherin表達情況對前列腺癌預后及免疫治療療效評估具有重要價值。