[發(fā)明專利]一種板栗胚軸超低溫保存和恢復(fù)培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010622769.2
• 申請日: 2020-07-01
• 公開（公告）號: CN111685109A
• 公開（公告）日: 2020-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓彪;咸洋;解孝滿;李文清;陸璐;董昕;劉鹍;劉濤;陳吉強(qiáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省林木種質(zhì)資源中心
• 主分類號: A01N3/00
• 分類號: A01N3/00;A01H4/00
• 代理公司: 北京弘權(quán)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11363
• 代理人: 逯長明;許偉群

本申請公開了一種板栗胚軸超低溫保存和恢復(fù)培養(yǎng)方法。通過胚軸脫水處理、加載處理、玻璃化處理、超低溫儲藏處理、解凍處理、卸載處理，完成對板栗胚軸的超低溫保存。通過本申請的板栗胚軸超低溫保存方法獲得的板栗胚軸具有萌發(fā)率高的特點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物種子(胚)保存技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種板栗胚軸超低溫保存和恢復(fù)培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

板栗(Castanea mollissima Bl.)屬殼斗科栗屬植物，是我國重要的木本糧食樹種，種子營養(yǎng)價(jià)值高，分布廣泛，種植面積大，產(chǎn)業(yè)化水平高，素有“干果之王”、“鐵桿莊稼”的美稱。我國是全球板栗的原產(chǎn)地和主產(chǎn)區(qū)，種植面積和產(chǎn)量均居世界第一。板栗種質(zhì)資源極為豐富，全國大部分省份均有分布，但是由于板栗種子是典型的頑拗性種子，不耐脫水和低溫，無法按照正常型種子保存方法長期保存，超低溫保存作為頑拗性種子長期保存的重要途徑，將是板栗種子保存的重要方向。

目前，現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于板栗種子超低溫保存研究主要集中在板栗胚軸不同冷凍方式和解凍方式對板栗胚軸超低溫保存的影響。但是均存在超低溫保存后胚軸萌發(fā)率較低的問題(低于30％)。

因此，亟需一種板栗胚軸超低溫保存和恢復(fù)培養(yǎng)方法，以解決現(xiàn)有板栗胚軸超低溫保存后胚軸萌發(fā)率較低的技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容

本申請?zhí)峁┝朔N板栗胚軸超低溫保存和恢復(fù)培養(yǎng)方法，以解決現(xiàn)有板栗胚軸超低溫保存后胚軸萌發(fā)率較低以及沒有形成超低溫保存和恢復(fù)培養(yǎng)的完整體系的技術(shù)問題。

為了解決上述技術(shù)問題，本申請實(shí)施例公開了如下技術(shù)方案：

根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的第一方面，提供了一種板栗胚軸超低溫保存方法，所述方法包括：

步驟一：切取板栗中含有胚軸的大塊組織，對所述大塊組織塊進(jìn)行表面消毒，然后切取超低溫貯藏所需胚軸組織，對所述胚軸組織脫水；

步驟二：將脫水后的胚軸組織，放入經(jīng)滅菌的凍存管中，加入上載液，做加載處理；

步驟三：加載處理結(jié)束后，移除上載液，加入預(yù)冷的PVS₂溶液，做玻璃化處理；

步驟四：將經(jīng)玻璃化處理后含胚軸組織的凍存管快速放入生物樣品液氮罐貯藏，做超低溫儲藏處理；

步驟五：超低溫儲藏處理后，對胚軸進(jìn)行解凍處理；

步驟六：對解凍處理后的凍存管消毒，吸盡PVS₂溶液，加入卸載液，做卸載處理。

優(yōu)選地，所述上載液組成為：2M甘油+0.4M蔗糖，溶解于WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，調(diào)整溶液pH＝5.8。

優(yōu)選地，所述PVS₂溶液組成為：30％甘油+15％乙二醇+15％二甲基亞砜+0.4mol/L蔗糖，溶解于WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，調(diào)整溶液pH＝5.8。

優(yōu)選地，所述卸載液組成為：1.2M蔗糖，溶解于WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，調(diào)整溶液pH＝5.8。

根據(jù)本申請的第二方面，提供了一種板栗胚軸超低溫保存后恢復(fù)培養(yǎng)方法，經(jīng)由本申請第一方面提供的板栗胚軸超低溫保存方法處理后獲得的板栗胚軸做恢復(fù)培養(yǎng)，所述恢復(fù)培養(yǎng)方法包括：

板栗胚軸卸載處理結(jié)束后，吸盡卸載液，加入WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗，再吸盡WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，之后將胚軸轉(zhuǎn)接在超低溫恢復(fù)培養(yǎng)基上。

優(yōu)選地，所述恢復(fù)培養(yǎng)基組成為：WPM+1.5mg/L 6-芐氨基嘌呤(6-BA)+0.1mg/L萘乙酸(NAA)+1g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)+1g/L活性炭+30g/L蔗糖+3g/L瓊脂(Agar)，調(diào)整溶液pH＝5.8。