[發明專利]一種篩選能將L-氨基酸轉化為2-酮酸酶的方法

在審

• 申請號: 202010616419.5
• 申請日: 2020-06-30
• 公開（公告）號: CN111951898A
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發明（設計）人: 吳邊;李濤;崔雪賢;李瑞峰
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: G16B50/00
• 分類號: G16B50/00;G16B30/10;C12P7/40
• 代理公司: 北京律和信知識產權代理事務所(普通合伙) 11446
• 代理人: 張羽;武玉琴

本發明屬于L?氨基酸發酵的技術領域。本發明提供一種篩選能將L?氨基酸轉化為2?酮酸酶的方法，包括如下步驟：用每個亞家族HMM圖譜對最終數據庫中的序列進行評分獲得E值低于0.001的序列；得到屬于I和II類的15個AT。本發明的有益效果：AT來源廣泛，易于異源表達，無需額外添加昂貴的輔因子；高活性，高立體選擇性等優點。

技術領域

本發明涉及2-酮酸、D-氨基酸生物催化合成的技術領域。

背景技術

近些年，代謝工程和合成生物學的發展使L-氨基酸的發酵取得了巨大成功。 2017年全球氨基酸產量約為850萬噸，預計到2022年將達到1100萬噸。而隨著現代生物技術的進一步發展，L-氨基酸的生產成本在持續走低。我國作為氨基酸生產和消費大國，大宗型氨基酸產品長期處于供過于求的狀態。因此，使用L- 氨基酸作為初始原料生產高附加值產品成為亟待解決的問題。

2-酮酸作為L-氨基酸合成的直接前體物質在人類和動物的新陳代謝中起著重要的作用，并被廣泛應用于醫藥，食品和農業等領域中。但是目前2-酮酸的合成主要是依賴化學方法，這些方法需要昂貴的催化劑或特殊的起始化合物，從而存在高生產成本和環境不友好等缺點。

采用生物酶法催化天然L-氨基酸轉化為2-酮酸在可持續性方面具有突出的優勢：可再生資源作為起始原料，溫和的反應條件和高原子經濟性。基于此，目前發現有四類酶可以催化L-氨基酸生成2-酮酸，即L-氨基酸脫氫酶(LADH)， L-氨基酸氧化酶(LAAO)，L-氨基酸脫氨酶(LAAD)和L-氨基酸氨基轉移酶 (AT)。

盡管高效率以及高對映選擇性和區域選擇性使AT具有參與酶促級聯反應和 2-酮酸合成的能力，但是AT一般只接受一組相似氨基酸作為底物，這種底物耐受性阻礙了該技術的廣泛應用。此外，某些氨基酸(如蘇氨酸，賴氨酸和精氨酸)并沒有對應的轉氨酶或者一些轉氨酶活性較低。因此，如何通過生物信息學手段尋找兼容上述反應體系的新型AT以擴大底物接受范圍成為本領域研究的難點。

由于近年來手性非天然氨基酸在制藥和農業化學工業中受到越來越多的關注，因此非常需要一種由生產的2-酮酸合成D-氨基酸和N-甲基化氨基酸的經濟有效的方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種篩選能將L-氨基酸轉化為2-酮酸酶的方法，包括如下步驟：用每個亞家族HMM圖譜對最終數據庫中的序列進行評分獲得E值低于0.001的序列；得到屬于I和II類的15個AT。

進一步地，所述最終數據庫中的序列的獲得方法，包括：將UniprotKB數據庫中源自細菌和古細菌的未被研究的AspAT/ARAT和AlaAT序列下載為數據集，然后對數據集去除冗余序列得最終數據庫的序列。

進一步地，所述HMM亞家族圖譜的建立方法，包括：從Swiss-Port檢索已被研究確認的AspAT/ARAT和AlaAT的序列；對這些序列去除冗余，使用 HMMER軟件包建立HMM亞家族圖譜。

更進一步地，所述去除冗余序列的方法為去除氨基酸個數＞200且與 AspAT/ARAT或AlaAT序列的相似度＜90％的序列。

本發明的有益效果：

1.AT來源廣泛，易于異源表達，無需額外添加昂貴的輔因子；高活性，高立體選擇性等優點。

2.使用廉價且可再生的底物和輔助因子，無需額外添加其他輔因子再生系統，將不利的化學平衡轉移到產物的合成方向，減弱了2-酮戊二酸對轉氨酶的抑制作用。

3.反應條件溫和(pH 8.0-8.5，30℃)，底物轉化率高，目標化合物的HPLC 收率很高(＞92.7％)，且具備高立體選擇性(產物ee值＞99％)。

附圖說明

圖1.L-氨基酸轉化為2-酮酸的多酶級聯反應圖。