[發明專利]一種膠原蛋白水凝膠的制備方法

有效

• 申請號: 202010610348.8
• 申請日: 2020-06-29
• 公開（公告）號: CN111704663B
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發明（設計）人: 許菲;胡金遠
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K14/78
• 分類號: C07K14/78;C07K19/00;C12N15/12;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;C08J3/075;C12R1/19;C08L89/00
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了一種膠原蛋白水凝膠的制備方法，屬于基因工程技術領域。本發明以N和C端E3和K3異源α?螺旋為基礎，在中間插入連續的Gly?Xaa?Yaa三聯體的膠原蛋白序列，形成三段式的嵌合膠原蛋白E3?collagen?K3模式。通過N和C端的E3和K3異源α?螺旋的相互作用驅動自組裝，形成首尾相連的網狀疏松多孔的膠原蛋白水凝膠。本發明的方法可制備得到清潔來源的膠原蛋白，其能自發組裝形成膠原蛋白水凝膠，制備工藝簡單，能夠大規模生產成本低的膠原蛋白水凝膠，在生物材料領域有著廣闊的應用前景。

技術領域

本發明涉及一種膠原蛋白水凝膠的制備方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術

膠原蛋白是由三條鏈相互纏繞形成的三股螺旋，是哺乳動物中含量最多的蛋白，占人體蛋白的1/3，能高度特異性組裝形成膠原纖維，為細胞外基質的主要成分，能夠控制細胞的生長分化，可用于人體組織和器官的修復和再生。膠原蛋白水凝膠是一種可生物降解的，富含水的三維材料，能夠提供生物信號和作為細胞支架，提供細胞生長，分化和遷移所需要的微環境，可用于關節軟骨填充劑。

膠原蛋白目前來源主要為以下五種：目前最主要的來源是動物皮膚提取，雖然價格低廉，但是容易攜帶病源；化學合成多肽雖然可控性強、純度高，但是最明顯的缺點就是價格昂貴、長度受限制、不適合批量生產。利用轉基因植物和哺乳動物細胞等真核體系表達的優勢在于能夠指導蛋白質的正確折疊，提供復雜的翻譯后加工功能，但是普遍存在的問題是培養成本高、周期長、表達量低和難于規模化生產。微生物表達體系具有成本低和表達量高等明顯優勢。目前研究表明，越來越多的哺乳動物和細菌膠原被證實能夠在細菌和酵母等宿主中高效的異源表達，并且正確折疊成膠原三股螺旋。重組膠原在生物材料生產中具有潛在的應用，但是缺乏形成高級結構的自組裝驅動力，不能形成更高級的結構，限制了其在生物材料和組織工程方面的應用。Barbara Brodsky和Magnus Hook等人都通過在大腸桿菌中異源表達釀膿鏈球菌插入有整合素作用位點的膠原蛋白Scl2，證明了經修飾的膠原蛋白能夠可以作為纖維細胞，內皮細胞和平滑肌細胞的基底^[1,2]。Molly M.Stevens等人通過在Scl2序列中插入透明質酸和硫酸軟骨素結合位點，然后利用金屬基質水解酶7(MMP7)敏感肽交聯形成生物降解水凝膠，有望用于關節軟骨的再生^[3]。

1.An,B.,et al.,The influence of specific binding of collagen–silkchimeras to silk biomaterials on hMSC behavior.Biomaterials,2013.34(2):p.402-412.

2.Seo,N.,et al.,An engineered α1 integrin-binding collagenoussequence.Journal of Biological Chemistry,2010.285(40):p.31046-31054.

3.Cosgriff-Hernandez,E.,et al.,Bioactive hydrogels based on DesignerCollagens.Acta Biomaterialia,2010.6(10):p.3969-3977.

發明內容

本申請通過在膠原蛋白的N端和C端融合表達E3和K3異源α螺旋，促進膠原的高聚自組裝，形成膠原蛋白水凝膠。

本發明的第一個目的是提供一種膠原蛋白分子，組成所述膠原蛋白分子的肽鏈具有如下結構：

(a)按如下順序含有：E3α螺旋、V-doamin、多個重復的GXY和K3α螺旋；

(b)在(a)的基礎上對CL-domain的一個或幾個氨基酸進行缺失、取代或增減且具有(a)的功能特性的由(a)衍生的蛋白質。

在一種實施方式中，組成所述膠原蛋白分子的肽鏈具有如下結構：