[發(fā)明專利]一種基于BPP法的甘蔗組織變性蛋白提取方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010597855.2
• 申請日: 2020-06-28
• 公開（公告）號: CN111718394A
• 公開（公告）日: 2020-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳忠良;黃東亮;秦翠鮮;汪淼;廖芬;周麗;李傲梅
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14
• 代理公司: 北京卓嵐智財知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11624
• 代理人: 任漱晨

1.一種基于BPP法的甘蔗組織變性蛋白提取方法，其特征在于：所述方法包括如下步驟：

步驟1：準備實驗器具和鮮組織樣本；

步驟2：把組織樣本在液氮的環(huán)境下研磨；

步驟3：使用BPP提取液對研磨后的組織樣本進行混合離心處理得到混合液；

步驟4：對混合液進行洗滌，提取蛋白。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于BPP法的甘蔗組織變性蛋白提取方法，其特征在于：所述步驟1的具體過程為：

步驟1.1：液氮準備，從液氮罐中倒取液氮到保溫杯，準備研缽及研棒，倒入覆蓋表面的無水酒精，灼燒后備用；

步驟1.2：準備新鮮組織樣本或從低溫冰箱中取出組織樣品，暫存于冰盒，立即連同盛有樣品的容器一起稱重，并記錄重量。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于BPP法的甘蔗組織變性蛋白提取方法的制備方法，其特征在于：所述步驟2的具體過程為：

步驟2.1：研磨開始前，研缽及研棒提前用液氮預(yù)冷；準備一個離心管，標記樣品名，放入盛有液氮的保溫杯預(yù)冷；

步驟2.2：取稱量好的組織樣本，放入預(yù)冷的研缽中，并快速攪動磨成干粉狀，在研磨過程中一邊研磨一邊補充液氮保持樣品低溫；

步驟2.3：研磨完成后，加入剛沒過組織樣本的液氮，將不銹鋼藥勺在液氮中預(yù)冷，并將濺在研缽內(nèi)的粉末用藥勺集中到研缽底部，將組織粉末收集到上述預(yù)冷的對應(yīng)離心管中，重新投入液氮中備用；

步驟2.4：將空的錫紙和離心管稱重，精確到0.1g，并樣品粉末加入到錫紙戒離心管稱重，計算組織樣品質(zhì)量。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種基于BPP法的甘蔗組織變性蛋白提取方法的制備方法，其特征在于：所述步驟3的具體過程為：

步驟3.1：根據(jù)組織樣品質(zhì)量，計算BPP提取液用量，BPP提取液的用量為每克的組織樣品使用7ml BPP提取液；

步驟3.2：研磨后分組織粉末按照3ml BPP buffer/1g組織樣本的計算方式加入BPP提取緩沖液，倒入溶液中，上下顛倒混勻，放入冰箱4℃水化1h備用；

步驟3.3：臨用前，加入二硫蘇糖醇，濃度為5mM；第一次抽提，臨用前加入苯甲基磺酰氟，濃度為1mM，混勻后，加入組織粉末中，充分混勻，超聲后漩渦震蕩5min；

步驟3.4：加入等體積的Tris飽和酚，其中Tris飽和酚的pH7.8，室溫渦混10min；

步驟3.5：使用離心機進行離心處理，溫度為4℃，離心轉(zhuǎn)速為12500rpm時間為15min；

步驟3.6：準備新的離心管，離心好后加入秱酚，再加入等體積的BPP提取緩沖液，BPP提取緩沖液臨用前，加入二硫蘇糖醇，終濃度為5mM，充分混勻后，室溫渦混10min；

步驟3.7：使用離心機進行離心處理，溫度為4℃，離心轉(zhuǎn)速為12500rpm時間為15min；

步驟3.8：準備新的離心管，離心好后轉(zhuǎn)加入秱酚，加入5倍體積的預(yù)冷的飽和硫酸銨甲醇溶液，-20℃沉淀過夜。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種基于BPP法的甘蔗組織變性蛋白提取方法的制備方法，其特征在于：所述步驟3.3中超聲后漩渦震蕩的次數(shù)為30次，每次后漩渦震蕩的時間為10s，間隙時間為10s。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種基于BPP法的甘蔗組織變性蛋白提取方法，其特征在于：所述步驟3.8中硫酸銨甲醇溶液由6.605g過硫酸銨粉末和500ml甲醇混合而成。