[發明專利]一種PCR熒光核酸檢測方法及其應用在審
| 申請號： | 202010592177.0 | 申請日： | 2020-06-24 |
| 公開（公告）號： | CN113832220A | 公開（公告）日： | 2021-12-24 |
| 發明（設計）人： | 胡立磊;胡春瑞;豆傳國;劉博;劉琦;陳昌 | 申請（專利權）人： | 上海駟格生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12Q1/686 | 分類號： | C12Q1/686;C12M1/38;C12M1/34;C12M1/00;B01L3/00 |
| 代理公司： | 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219 | 代理人： | 劉星 |
| 地址： | 201800 上海市嘉定區*** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 pcr 熒光 核酸 檢測 方法 及其 應用 | ||
1.一種PCR熒光核酸檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
采用微流體芯片進行樣品的PCR核酸擴增反應；
采用藍光激發樣品靶標的熒光標記分子，并采用PCR熒光檢測儀采集來自所述微流體芯片的熒光信號；
采用黃光激發樣品內標的熒光標記分子，并采用所述PCR熒光檢測儀采集來自所述微流體芯片的熒光信號；
基于所述PCR熒光檢測儀采集的熒光信號進行圖像處理與圖像分析，并進行結果判斷。
3.根據權利要求2所述的PCR熒光核酸檢測方法，其特征在于：所述循環階段的數量范圍是30-50個。
4.根據權利要求2所述的PCR熒光核酸檢測方法，其特征在于：在每個循環階段的所述擴增階段，于第一時間開啟藍光，于第二時間關閉藍光，于第三時間開啟黃光，于第四時間關閉黃光，其中，所述第一時間早于所述第二時間，所述第二時間早于所述第三時間，所述第三時間早于所述第四時間。
5.根據權利要求4所述的PCR熒光核酸檢測方法，其特征在于：在每個循環階段的所述擴增階段，于第五時間開始采集藍光激發的熒光信號，于第六時間停止采集藍光激發的熒光信號，于第七時間開始采集黃光激發的熒光信號，于第八時間停止采集黃光激發的熒光信號，其中，所述第五時間晚于所述第一時間并早于所述第六時間，所述第六時間不晚于所述第二時間，所述第七時間晚于所述第三時間并早于所述第八時間，所述第八時間不晚于所述第四時間。
6.根據權利要求4所述的PCR熒光核酸檢測方法，其特征在于：所述PCR熒光檢測儀采用連續拍照或視頻流的方式采集來自所述微流體芯片的熒光信號，其中，每一幀圖像的曝光時間小于所述第二時間與所述第一時間之差，并小于所述第四時間與所述第三時間之差。
7.根據權利要求6所述的PCR熒光核酸檢測方法，其特征在于：在每個循環階段的所述擴增階段，提取至少一張處于藍光開啟階段的圖像幀保存以供分析，提取至少一張處于黃光開啟階段的圖像幀保存以供分析。
8.根據權利要求7所述的PCR熒光核酸檢測方法，其特征在于：在每個循環階段的所述擴增階段，當提取多張處于藍光或黃光開啟階段的圖像幀保存時，將多張采集的圖像幀的像素進行平均。
9.根據權利要求1所述的PCR熒光核酸檢測方法，其特征在于：所述圖像處理包括尋找PCR反應腔區域，并提取所述PCR反應腔區域對應的像素。
10.根據權利要求1所述的PCR熒光核酸檢測方法，其特征在于：所述PCR熒光檢測儀輸出的圖像采用RGB彩色模式，所述圖像處理包括將輸出圖像的紅色通道和綠色通道的數據分別提取出來。
11.根據權利要求1所述的PCR熒光核酸檢測方法，其特征在于：所述圖像處理包括將PCR反應腔區域對應的像素值求平均值。
12.根據權利要求11所述的PCR熒光核酸檢測方法，其特征在于：所述圖像分析包括基于所述PCR核酸擴增反應的循環次數及每個循環對應的所述平均值繪制PCR反應曲線，并對前M個循環的數據求取方差值，將N倍方差值與所述PCR反應曲線的焦點的橫坐標記為Ct值，其中，M與N均為整數并小于總的循環次數。
13.根據權利要求12所述的PCR熒光核酸檢測方法，其特征在于：所述結果判斷包括將所述Ct值與標準Ct參考值進行比較，如果所述Ct值小于所述標準Ct參考值，則判斷樣品為陽性，如果所述Ct值大于所述標準Ct參考值，則判斷樣品為陰性。
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