[發(fā)明專利]一種基于上轉換熒光探針的單分子免疫檢測方法

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• 申請日: 2020-06-24
• 公開（公告）號: CN111735964A
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發(fā)明（設計）人: 何皓
• 申請（專利權）人: 深圳市光與生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58;G01N33/577;G01N33/574;G01N33/533;C09K11/02;C09K11/77
• 代理公司: 合肥廣源知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 34129
• 代理人: 胡麗虹

本發(fā)明屬于免疫檢測技術領域，具體涉及一種基于上轉換熒光探針的單分子免疫檢測方法，將被檢測樣品稀釋后滴加到檢測基板上，被檢測物與生物活性分子B結合，完成后沖洗檢測基板，然后滴加用稀釋的免疫熒光探針，使生物活性分子A與已經(jīng)和生物活性分子B結合的被檢測物結合，完成后沖洗檢測基板；將處理后的檢測基板置于熒光顯微鏡下，對免疫熒光探針數(shù)目進行計數(shù)，所得數(shù)目即為被檢測物的數(shù)目。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術具有以下優(yōu)點：采用高濃度稀土摻雜上轉換發(fā)光納米顆粒作為免疫熒光探針的基礎，結果在熒光顯微鏡下肉眼可讀，并可通過免疫熒光探針數(shù)目進行定量，適用于病原體、微生物、大分子抗原或抗體，可檢測范圍廣。

技術領域

本發(fā)明屬于免疫檢測技術領域，具體涉及一種基于上轉換熒光探針的單分子免疫檢測方法。

背景技術

免疫檢測在各種疾病檢測領域發(fā)揮著重要作用，現(xiàn)有的化學發(fā)光技術不可能實現(xiàn)單分子免疫檢測，其檢測靈敏度下限的瓶頸來源于分子層面的不確定性；吖啶類化學發(fā)光體系因無需催化劑、反應條件溫和、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，被廣泛應用于無機有機化合物、生物及藥物分析等領域，吖啶酯在遇到發(fā)光激發(fā)底物時，會在極短的時間內釋放數(shù)個光子，其后結構迅速遭到破壞失去發(fā)光能力；由于吖啶酯在釋放光子時，光子方向是不可控的，而作為發(fā)光檢測設備的核心部件光電倍增管（PMT）卻是有方向性的，這就使得單個吖啶酯釋放的少數(shù)幾個光子不能確保被PMT檢測到，同時PMT上捕獲的光子信號也不可能對溶液中單個吖啶酯分子進行溯源；當樣品中的抗原分子濃度低到一定程度時，PMT能夠捕獲到光子數(shù)量的不確定性將呈指數(shù)級提高，導致檢測信號完全被埋沒于背景噪音中，失去定量檢測能力，同樣的問題也存在于電化學發(fā)光和酶促化學發(fā)光體系中。因此，在設備自動化技術已經(jīng)發(fā)展到相當高水平的今天，現(xiàn)有的化學發(fā)光技術檢測靈敏度已經(jīng)接近于其理論上的檢測極限水平，無法達到單分子檢測水平。免疫檢測在各種疾病監(jiān)測領域發(fā)揮著重要作用，隨著技術的進步，對免疫檢測的靈敏度要求越來越高，現(xiàn)有主流的化學發(fā)光技術靈敏度難以實現(xiàn)單分子水平檢測，直接導致部分極低濃度的目標分子檢測成了不可完成的任務，因此，如何在現(xiàn)有技術基礎上提高探針的熒光信號強度，以實現(xiàn)單個探針能夠很容易的被檢測到的技術效果。

上轉換納米材料是一類稀土離子摻雜的無機納米材料，能夠連續(xù)洗洗手兩個或連個以上的近遠紅外光子（一般980nm），發(fā)射出高能量的紫外-可見光，由于其近紅外激發(fā)的性質，上轉換納米材料可以有效地避免生物樣本本身的自發(fā)熒光和散射光的干擾，而且能有效降低紫外或者可見光激發(fā)對生物樣品的光損傷，在免疫檢測中能夠提高靈敏度和信噪比，但上轉換稀土納米材料水溶性和分散性差，因此需要通過化學修飾后與生物分子偶聯(lián)，已解決現(xiàn)有主流的化學發(fā)光技術靈敏度低的問題。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有主流的化學發(fā)光技術的靈敏度無法實現(xiàn)單分子水平檢測的問題，提供了一種基于上轉換熒光探針的單分子免疫檢測方法。

本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：一種基于上轉換熒光探針的單分子免疫檢測方法，包括免疫熒光探針、檢測基板以及被檢測樣品；

所述免疫熒光探針為通過在高濃度稀土摻雜上轉換納米材料顆粒表面修飾免疫檢測所需要的生物活性分子A得到；

所述檢測基板為通過在基板上修飾用于捕獲被檢測物的生物活性分子B；

所述被檢測樣品中含有被檢測物，所述被檢測物為病原體、微生物、大分子抗原或抗體；

所述被檢測物為病原體、微生物或大分子抗原時，生物活性分子A為可與被檢測物特異性結合的抗體A，生物活性分子B為可與被檢測物特異性結合的抗體B；所述被檢測物為抗體時，生物活性分子A為可被被檢測物特異性識別的抗體A，生物活性分子B為可被被檢測物特異性識別的抗原；