[發(fā)明專利]一種提高核酸穩(wěn)定性的保存液及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010587255.8
• 申請日: 2020-06-24
• 公開（公告）號: CN111718927A
• 公開（公告）日: 2020-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹林;聶俊偉;瞿志鵬;張力軍;江明揚(yáng);韓錦雄
• 申請（專利權(quán)）人: 南京諾唯贊生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 杜靜;徐冬濤

本發(fā)明公開一種提高核酸穩(wěn)定性的保存液及其應(yīng)用，本發(fā)明所述的保存液，包括10mM～500mM三羥甲基氨基甲烷(Tris)、1～20mg/ml的非離子表面活性劑、1mM～0.5MEDTA、10mM～500mM無機(jī)鹽、0.1～20mg/ml山梨糖醇中的一種或幾種。本發(fā)明所述的保存液不僅可以直接用于后續(xù)提取步驟，不需要離心去除，不僅不影響硅膠質(zhì)膜和磁珠對核酸的吸附，且可以促進(jìn)后續(xù)核酸提取時核酸對離心柱和磁珠的吸附作用，提高提取得率并節(jié)約時間。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高核酸穩(wěn)定性的保存液及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

微生物(microorganism)是存在于自然界的一群體形微小、結(jié)構(gòu)簡單的微小生物。微生物肉眼不可見，必須借助光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡進(jìn)行放大才能觀察到。微生物在自然界是廣泛存在的，其中，有一部分微生物可以侵犯人體引起感染導(dǎo)致傳染病，這類微生物被稱為病原微生物。病原微生物包含朊毒體、寄生蟲(原蟲、蠕蟲、醫(yī)學(xué)昆蟲)、真菌、細(xì)菌、螺旋體、支原體、立克次體、衣原體、病毒，其中，以細(xì)菌和病毒的危害性最大。

病原微生物侵入人體后，人體就是病原微生物生存的場所，醫(yī)學(xué)上稱為病原微生物的宿主。病原微生物在宿主中生長繁殖、釋放毒性物質(zhì)等引起機(jī)體不同程度的病理變化，這一過程稱為感染。病原微生物感染宿主后，通過不斷繁殖、變異和進(jìn)化，增強(qiáng)自己的毒力或致病力，進(jìn)而引發(fā)機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)，當(dāng)超過機(jī)體自身正常生理承受范圍，則表現(xiàn)出癥狀，引發(fā)疾病甚或是嚴(yán)重的傳染和感染性疾病。由病原微生物引起的傳染和感染性疾病是臨床面臨的最常見的疾病之一，約占常見疾病的50％。病原微生物因?yàn)榉敝晨臁⒑怂岵环€(wěn)定導(dǎo)致高度易變異，因而使得病原微生物呈現(xiàn)多樣性；此外，隨著人群結(jié)構(gòu)的變化、環(huán)境污染以及藥物濫用等因素的影響，使得病原微生物導(dǎo)致的疾病呈現(xiàn)復(fù)雜化的趨勢，嚴(yán)重威脅人類健康。

目前，常用的針對病原微生物檢測方法包括涂片鏡檢、生化反應(yīng)、免疫檢測、培養(yǎng)法、常規(guī)PCR法、qPCR、基因芯片技術(shù)、高通量測序(NGS)、質(zhì)譜等技術(shù)；其中，基于核酸的檢測，因?yàn)槠涓哽`敏度、高準(zhǔn)確率以及快速等特點(diǎn)，而成為確診的金標(biāo)準(zhǔn)，包括上述介紹的、常規(guī)PCR法、qPCR、基因芯片技術(shù)、高通量測序(NGS)等方法。

核酸包括脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)兩類,已知核酸是一切生物體的遺傳物質(zhì),在細(xì)胞主要存在于細(xì)胞核內(nèi),在病毒存在于病毒衣売內(nèi)。核酸因?yàn)楹苋菀妆画h(huán)境中存在的核酸酶分解，因此在一般的環(huán)境下能完整保存的時間很短；特別是RNA保存難度更大,一方面，因?yàn)镽NA是單鏈，極其不穩(wěn)定，另一方面，常規(guī)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中廣泛存在RNA酶(RNase)，且Rnase非常穩(wěn)定，難以去除。因此，如何從樣品中得到高品質(zhì)及完整的核酸一直是生物領(lǐng)域亟待解決的問題。

在核酸保存方面，美國Ambion公司(現(xiàn)為Thermo Fisher公司收購)開發(fā)了一種可保存完整細(xì)胞的溶液RNAlater，該產(chǎn)品由檸檬酸鈉、乙二胺四乙酸(EDTA)與硫酸銨組成。RNAlater保存的核酸樣品在37攝氏度下可穩(wěn)定保存一天，不會明顯降解。此外，胍鹽(異硫氰酸胍或鹽酸胍等)作為一種經(jīng)典的蛋白變性劑，常用于核酸提取中的細(xì)胞裂解，因而，市場上有很多基于胍鹽開發(fā)的核酸保存液。

在核酸提取方面，目前，傳統(tǒng)方法是酚/氯仿有機(jī)溶劑抽提，硅膠膜吸附離心柱法以及兼容自動化平臺廣泛應(yīng)用的磁珠法核酸提取方法。酚/氯仿提取的原理主要是苯酚使蛋白質(zhì)變性，同時抑制了核酸酶的降解作用；氯仿可以制造分相，蛋白分子溶于酚相，而核酸溶于水相。此外，在提取過程中經(jīng)常加入異戊醇促進(jìn)分相，并通過降低表面張力，去減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡，維持分相穩(wěn)定。離心柱法采用的硅膠質(zhì)膜經(jīng)過修飾，表面帶有大量的陰離子基團(tuán)，在高鹽低pH時，可以高效吸附核酸。磁珠法核酸提取采用的是超順磁性氧化硅納米磁性微珠(以下簡稱磁珠)為載體,通過磁珠在高鹽溶液中吸附核酸，而不吸附蛋白和其他雜質(zhì)；在低鹽溶液中核酸從磁珠表面解吸附，從而達(dá)到快速分離純化核酸的目的。目前，離心柱純化法和磁珠純化法因?yàn)槠涮崛〉募兌雀摺a(chǎn)量高，受人為操作因素影響小，可以兼容自動化(磁珠法)而得到廣泛應(yīng)用。