[發(fā)明專利]一種構(gòu)建偽狂犬病毒基因缺失弱毒株的方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010580858.5
• 申請日: 2020-06-23
• 公開（公告）號: CN111635891B
• 公開（公告）日: 2022-08-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 商營利;孔正杰
• 申請（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/90;C12N15/85;A61K39/245;A61P31/22;C12R1/93
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 莫舒穎

本發(fā)明提供一種構(gòu)建偽狂犬病毒基因缺失弱毒株的方法及其構(gòu)建的重組病毒與應(yīng)用。本方法利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建偽狂犬病毒基因缺失弱毒株，該方法構(gòu)建的偽狂犬病毒基因缺失弱毒株在UL13基因部位發(fā)生特異性缺失突變。所得偽狂犬病毒基因缺失弱毒株誘導的I型IFN基因表達量顯著提高，能產(chǎn)生更強的天然免疫反應(yīng)，而病毒自身的復制無顯著差異。因此，UL13基因缺失突變能顯著降低偽狂犬病毒導致的免疫抑制，具有重要的潛在應(yīng)用價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種構(gòu)建偽狂犬病毒基因缺失弱毒株的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

偽狂犬病是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的包括多種家畜和野生動物共患的一種急性傳染病。豬是該病毒的天然宿主和貯存者，偽狂犬病毒感染可引起母豬流產(chǎn)、死胎，公豬不育，仔豬神經(jīng)紊亂及死亡和育肥豬呼吸道疾病等。變異毒株的出現(xiàn)使得成年豬也表現(xiàn)出與仔豬相似的嚴重癥狀，給該病的防控增加了新的難題。預防豬偽狂犬病最行之有效的辦法是接種疫苗，但經(jīng)典的Bartha-K61弱毒疫苗免疫所產(chǎn)生的抗體對目前流行毒株的中和能力弱，已經(jīng)不能提供高效的保護。針對當前豬偽狂犬病的流行現(xiàn)狀，有必要對經(jīng)典疫苗株Bartha-K61或變異毒株進行改造，研制免疫效力更強、安全性更好的新型基因缺失疫苗，有效的預防和控制豬偽狂犬病。

宿主天然免疫系統(tǒng)是抵抗感染的第一道防線。為了適應(yīng)宿主細胞，甲型皰疹病毒如偽狂犬病毒等進化出了多種策略拮抗宿主抗病毒免疫反應(yīng)，這些免疫逃逸策略對于甲型皰疹病毒在宿主體內(nèi)建立持續(xù)感染具有重要意義。例如，研究顯示偽狂犬病毒強毒株感染能夠顯著抑制干擾素(Interferon，IFN)誘導的STAT1的活化及其下游ISGs的表達，表明偽狂犬病毒能夠抑制宿主IFN介導的抗病毒免疫反應(yīng)。另外，研究發(fā)現(xiàn)偽狂犬病毒脫氧尿苷磷酸酶UL50和間質(zhì)蛋白US3均能抑制IFN-STAT信號通路活化。綜上所述，偽狂犬病毒能夠通過多種病毒蛋白抑制宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何降低偽狂犬病毒導致的免疫抑制，通過構(gòu)建免疫效力更強、安全性更好的新型基因缺失疫苗株，來實現(xiàn)對豬偽狂犬病的有效預防和控制。

偽狂犬病毒UL13基因編碼一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在病毒的成熟、組裝及復制過程中發(fā)揮重要作用。我們首次發(fā)現(xiàn)，間質(zhì)蛋白UL13是偽狂犬病毒導致宿主免疫抑制的關(guān)鍵蛋白，能夠顯著抑制宿主IFN以及下游ISGs的表達，從而抑制宿主天然免疫和促進病毒的免疫逃逸。因此，構(gòu)建偽狂犬病毒UL13基因缺失株是開發(fā)新型偽狂犬病毒基因缺失疫苗的一種有效手段。

本發(fā)明提供了一種構(gòu)建重組偽狂犬病毒的方法，包括降低目的偽狂犬病毒中UL13蛋白活性、降低目的偽狂犬病毒中UL13蛋白含量或/和降低目的偽狂犬病毒中UL13基因的表達量，得到構(gòu)建的重組偽狂犬病毒。

上述方法中，所述UL13蛋白為如下A1)或A2)的蛋白質(zhì)：

A1)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；

A2)與A1)具有98％以上同一性且來源于偽狂犬病毒的同源蛋白質(zhì)。

所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用國際互聯(lián)網(wǎng)上的同源性檢索站點測定氨基酸序列的同一性，如NCBI主頁網(wǎng)站的BLAST網(wǎng)頁。例如，可在高級BLAST2.1中，通過使用blastp作為程序，將Expect值設(shè)置為10，將所有Filter設(shè)置為OFF，使用BLOSUM62作為Matrix，將Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分別設(shè)置為11，1和0.85(缺省值)并進行檢索一對氨基酸序列的同一性進行計算，然后即可獲得同一性的值(％)。所述98％以上的同一性可為至少98％、99％或100％的同一性。

上述方法中，所得重組偽狂犬病毒誘導的宿主I型IFN表達量高于所述目的偽狂犬病毒，且復制能力與所述目的偽狂犬病毒沒有顯著差異。