[發明專利]一種病毒形式的新型冠狀病毒核酸標準物質及其制備方法

有效

• 申請號: 202010579907.3
• 申請日: 2020-06-23
• 公開（公告）號: CN111850164B
• 公開（公告）日: 2022-06-17
• 發明（設計）人: 林婧;王尚君;夏雪;徐峰;朱文
• 申請（專利權）人: 南京市計量監督檢測院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686
• 代理公司: 北京東方尚禾專利代理事務所(特殊普通合伙) 11844
• 代理人: 李厚銘

本發明公開了一種病毒形式的新型冠狀病毒核酸標準物質，所述標準物質以病毒為載體，包裹新型冠狀病毒核酸檢測的靶標基因。本發明還公開了一種病毒形式的新型冠狀病毒核酸標準物質的制備方法，包括：合成靶標基因；將靶標基因分別載入病毒質粒載體；將病毒質粒轉化入大腸桿菌進行培養；分離、回收病毒質粒；將病毒質粒轉染HEK293T細胞并進行病毒包裝；將包裝好的病毒顆粒提純、重懸后，加凍干保護劑分裝，經真空冷凍干燥后封裝。本發明具有病毒擬似結構和新型冠狀病毒的特異性核酸序列，可以作為新型冠狀病毒的標準品實現RNA的絕對定量，并且可以參與從病毒核酸提取到PCR結果讀取的全部檢測步驟，控制核酸檢測結果的準確性。

技術領域

本發明涉及一種病毒形式的新型冠狀病毒核酸標準物質及其制備方法，屬于生物檢測技術領域。

背景技術

核酸(DNA或RNA)是病毒的遺傳物質，任何物種都有獨一無二的核酸序列，所以對新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的特征序列進行核酸檢測，就可以知道是否感染了新冠病毒。熒光定量PCR技術是目前進行病毒核酸定量檢測的主要技術。檢測步驟主要包含從病毒中提取基因片段，RNA逆轉錄為DNA，DNA擴增放大和核酸含量讀取。

熒光定量PCR技術的直接測量結果是Ct值，即隨著檢測目標基因的循環復制，每個反應管內的熒光信號累積到達設定的域值時所經歷的PCR反應循環數。每個核酸模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。想要將Ct值轉換成被測核酸樣品的拷貝數，就需要與被測核酸片段一樣的標準物質，標準物質中被測核酸片段的含量是已知的、準確的。利用已知起始拷貝數的標準物質作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值。因此，只要通過PCR檢測獲得被測核酸樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。所以，新型冠狀病毒核酸標準物質是用PCR技術測量新冠病毒核酸拷貝數的必要工具，也是核酸檢測試劑盒研發和生產過程中準確定值所必需的。此外，該標準物質也可以作為陽性參考品與被測樣品進行平行操作，以控制病毒核酸檢測結果的準確性。

目前，用于新型冠狀病毒核酸檢測的標準物質僅有中國計量科學研究院發布的高低兩種濃度水平的新型冠狀病毒核酸標準物質(編號：GBW(E)091089和GBW(E)091090)，和上海市計量院發布的2種新型冠狀病毒體外轉錄RNA標準物質(編號：GBW(E)091111和GBW(E)091112)。上述標準物質均為RNA形式。現有的核酸標準物質均為核酸形式。用核酸形式的標準物質進行RT-PCR檢測的步驟是反轉錄(RT)、核酸擴增(PCR)以及Ct結果讀取。可以看出，相較于病毒的核酸PCR檢測來說，由于裸露的核酸沒有病毒結構，其檢測過程缺少了從病毒種提取核酸這一步驟，導致核酸形式的標準物質無法參與病毒檢測的每一步驟，從而無法進行病毒核酸檢測全過程的標準化和質量控制。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的缺陷，提供一種病毒形式的新型冠狀病毒核酸標準物質及其制備方法，該標準物質是以病毒為載體，包裹新型冠狀病毒核酸檢測的靶標基因，具有病毒擬似結構和新型冠狀病毒的特異性核酸序列，可以作為新型冠狀病毒的標準品實現RNA的絕對定量，即將熒光定量PCR測量結果Ct值轉換為拷貝數，并且可以參與從病毒核酸提取到PCR結果讀取的全部檢測步驟，控制核酸檢測結果的準確性。

為解決上述技術問題，本發明提供一種病毒形式的新型冠狀病毒核酸標準物質，所述標準物質以病毒為載體，包裹新型冠狀病毒核酸檢測的靶標基因。

優選地，所述靶標基因為ORF1ab、N基因和E基因。

優選地，所述病毒載體還包裹內參基因hRNaseP基因。

本發明還提供一種病毒形式的新型冠狀病毒核酸標準物質的制備方法，包括：

合成靶標基因；

將靶標基因分別載入病毒質粒載體；

將病毒質粒轉化入大腸桿菌進行培養；