[發(fā)明專利]一種廢水的發(fā)育神經(jīng)毒性評估方法

有效

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• 申請日: 2020-06-22
• 公開（公告）號: CN111713435B
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳兵;陳玲
• 申請（專利權(quán)）人: 南京大學(xué)
• 主分類號: A01K61/10
• 分類號: A01K61/10;G01N21/64;G01N33/18
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務(wù)所 32237
• 代理人: 肖明芳

1.一種廢水的發(fā)育神經(jīng)毒性評估方法，其特征在于，將huc:eGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎暴露于待檢測的廢水中至24 hpf，將暴露后的胚胎取出后，于熒光倒置顯微鏡下觀察，并采集圖像進行分析；

其中，將廢水預(yù)處理后得到待檢測的廢水，所述的預(yù)處理包括：（1）調(diào)節(jié)pH；（2）過濾雜質(zhì)；（3）將野生型斑馬魚胚胎暴露于廢水中，記錄胚胎死亡情況，根據(jù)胚胎死亡情況評估結(jié)果，對廢水進行濃縮或稀釋至0%＜致死率≤20%；

其中，所述的分析為從采集的圖像中直接觀察，綠色熒光表達越弱，所對應(yīng)的廢水對發(fā)育神經(jīng)的毒性越大，或，所述的分析為通過圖像處理軟件將采集所得到的圖轉(zhuǎn)化為灰度圖像，通過計算平均灰度對熒光值進行半定量，熒光值越小，所對應(yīng)的廢水對發(fā)育神經(jīng)的毒性越大。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廢水的發(fā)育神經(jīng)毒性評估方法，其特征在于，所述的huc:eGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎的獲取方法包括如下步驟：

S1：將huc:eGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚成魚飼養(yǎng)于魚缸中，雌魚和雄魚要分開養(yǎng)殖，其養(yǎng)殖條件均一樣：水溫為28℃，光照周期為14 h光照，10 h黑暗，養(yǎng)殖密度為5-8尾/L，每天中、晚各喂食一次蝦；

S2：每天第二次喂食結(jié)束后30 min后進行配魚，魚缸盛水量為魚缸體積的三分之二，每個魚缸中為兩雌一雄或一雌一雄，魚缸中間用隔板將雌雄分開，次日光照開啟時抽去隔板，13~20 min雌魚開始排卵，在30~40 min 時收集胚胎，去除死卵、糞便和其它雜物，用E3培養(yǎng)基洗滌數(shù)次，轉(zhuǎn)移到28.5°C恒溫培養(yǎng)箱中待用；

其中，所述的E3培養(yǎng)基中，各組分的濃度為：5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl₂·2H₂O，0.33 mM MgSO₄·7H₂O；溶劑為水，pH為7.2~7.4。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廢水的發(fā)育神經(jīng)毒性評估方法，其特征在于，步驟（1）中，將廢水的pH調(diào)節(jié)為7.0~7.6。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廢水的發(fā)育神經(jīng)毒性評估方法，其特征在于，步驟（2）中，將步驟（1）處理后的廢水先通過0.45 μm的濾膜過濾，將濾液再通過0.22 μm的濾膜過濾。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廢水的發(fā)育神經(jīng)毒性評估方法，其特征在于，步驟（3）中，將野生型斑馬魚胚胎移入孔板中，每孔10顆，移除孔板中胚胎的培養(yǎng)液，再向孔板中加入2 mL步驟（2）處理后的廢水，使得轉(zhuǎn)基因斑馬魚持續(xù)在廢水中暴露至24 hpf，觀察計算胚胎的致死率；

若致死率為0%，則將步驟（2）處理廢水濃縮后用于暴露實驗，直至0%＜致死率≤20%；若致死率高于20%，則將步驟（2）處理廢水用E3培養(yǎng)基稀釋，直至0%＜致死率≤20%，即得待檢測的廢水；

其中，所述的E3培養(yǎng)基中，各組分的濃度為：5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl₂·2H₂O，0.33 mM MgSO₄·7H₂O；溶劑為水，pH為7.2~7.4。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廢水的發(fā)育神經(jīng)毒性評估方法，其特征在于，所述的暴露為將huc:eGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎移入孔板中，每孔10顆，移除孔板中胚胎的培養(yǎng)液，再向孔板中加入2 mL廢水，使得轉(zhuǎn)基因斑馬魚持續(xù)在廢水中暴露至24 hpf。