[發明專利]一種支原體的通用PCR檢測方法及其檢測試劑盒

在審

• 申請號: 202010576699.1
• 申請日: 2020-06-22
• 公開（公告）號: CN111549159A
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發明（設計）人: 沈青春;羅玉峰;王芳;劉博;耿仁浩;曲鴻飛;魏津;蔣卉;馬欣;肖璐;王德麗;馮宇
• 申請（專利權）人: 中國獸醫藥品監察所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所(普通合伙) 11305
• 代理人: 鄭明

本發明涉及一種支原體通用PCR檢測方法及其檢測試劑盒。本發明選取16S rRNA序列V6高變區和V9高變區序列作為支原體特異性通用引物設計區域，在保證特異性的前提下，多處引入兼并堿基，設計并篩選獲得MF20.1/MF20.2/MR21(序列1/序列2/序列3)作為支原體的通用PCR檢測引物，能最大范圍地檢測各種支原體(雞毒支原體、雞滑液囊支原體、牛支原體、豬鼻支原體、豬肺炎支原體、衣阿華支原體等)。特異性檢測結果表明，各種動物細胞(Vero細胞、SP?20細胞、Marc 145細胞等)、細菌(大腸桿菌、沙門氏菌等)均無特異性擴增條帶。本發明PCR檢測方法具有靈敏度高、特異性強、重復性好等優點，可用于細胞、病毒培養物、組織液、血清、獸用生物制品及人類疫苗及生物制品的支原體檢測與檢驗。

本發明涉及一種支原體的通用PCR檢測方法及其檢測試劑盒，屬于微生物領域的支原體鑒別檢測。

支原體是當前所發現的能夠獨立繁殖的最小生物，其結構簡單，缺少細胞壁，沒有固定的形態，在固體培養基上一般呈“煎蛋狀”菌落。基因組小，僅1000kb左右，是基因組最小的生殖支原體，僅600kb左右，G+C％低于30％。按照國際細菌系統分類標準，支原體為原核生物界、軟壁菌門、軟膜體綱、支原體目，支原體目下有三個科，為支原體科、無膽甾原體科及螺原體科，而與細胞支原體污染有關的主要為支原體科和無膽甾原體科成員。支原體的轉錄系統與革蘭氏陽性細菌的相似，在進化樹上也與革蘭氏陽性細菌有著較近的親緣關系，因此有人認為支原體是由革蘭氏陽性細菌退化而來。

支原體缺乏細胞壁，對青霉素類抗生素不敏感，但有具有革蘭氏陽性細菌的部分特點，因而對鏈霉素對敏感性也十分有限。支原體在人工培養過程中，培養液除了pH發生變化外，基本上能保持澄清透明，只在培養后期活菌滴度達到峰值時才會出現輕度混濁。這些特點也為支原體污染細胞和病毒培養物而不容被發現提供了良好支持。在細胞培養和病毒的細胞繁殖中，最為常見的污染就是支原體污染，細胞培養液中常用加入雙抗(青霉素和鏈霉素)抑制細菌污染，但對支原體的作用十分有限。

目前支原體的檢測方法主要包括常規分離培養法、酶聯免疫吸附試驗、核酸雜交技術和PCR技術。培養法仍是當前世界公認對檢測支原體的金標準，能較為準確地檢測支原體活菌，但該方法存在耗時長達30天，而且工作量大、受培養基質量和培養條件影響大等弊端。酶聯免疫吸附試驗采用抗體夾心法檢測支原體污染，具有良好的特異性和靈敏性，但檢測試劑盒生產成本高，試劑昂貴；DNA熒光染色法則通過檢測支原體基因組DNA中A-T富集區，特異性較差，通常作為輔助方法使用；核酸雜交技術由于特異性和敏感性有限，對操作要求較高，具體實際應用較為少見。PCR檢測方法以其快速、準確、高敏感性和特異性的特點，成為當前應用最多的一種支原體快速檢測方法，部分企業和單位也有開發出了一些可用的檢測試劑。

16S rRNA作為細菌特有的分子標記，已有廣泛的應用。細菌的16S rRNA全長約1500bp左右，其中含有12個明顯的高變區(V區)，即V1～V12高變區，這些高變區具有較強的種屬特異性，并被廣泛應用于微生物菌落的擴增子分析，成為物種分類的依據。本專利使用了16S rRNA的種屬特異性特點，通過從Silva數據庫下載SILVA_123_SSURef的16S rRNA數據庫，從中提取支原體的16S rRNA序列共計452條，再通過核苷酸比對，從選取V6高變區和V9高變區為引物設計目標區段，共設計9對引物，再通過試驗驗證其特異性和敏感性，獲得當前專利要求的特異性好、敏感性高的MF20.1/MR21引物，再通過后續試驗優化增加一條上游引物MF20.2，在保障特異性和敏感性的前提下，對支原體對擴增范圍更廣。

本發明對檢測引物設計中使用了多對兼并序列，在保證特異性的條件下，能最大范圍地檢測各種支原體，包括鴨支原體、無黃無膽甾原體、牛支原體、豬鼻支原體、豬肺炎支原體、衣阿華支原體等。特異性檢測結果表明，各種動物細胞包括Vero細胞、SP-20細胞、Marc 145細胞等均無擴增條帶，細菌包括大腸桿菌、沙門氏菌等均無擴增條帶。

發明內容