[發明專利]一種MC3R基因編輯的豬成纖維細胞系的制備方法有效
| 申請號： | 202010573717.0 | 申請日： | 2020-06-22 |
| 公開（公告）號： | CN111876442B | 公開（公告）日： | 2022-05-31 |
| 發明（設計）人： | 許明曙;劉國良;翟德滔;渠東存 | 申請（專利權）人： | 浙江青蓮食品股份有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/85 | 分類號： | C12N15/85;C12N15/12;C12N5/10;C12R1/91 |
| 代理公司： | 北京國翰知識產權代理事務所(普通合伙) 11696 | 代理人： | 孫超男 |
| 地址： | 314000 浙江*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 mc3r 基因 編輯 纖維 細胞系 制備 方法 | ||
【權利要求書】：
1.一種制備MC3R基因敲除的豬成纖維細胞系的方法，其特征在于：
S1、構建基因敲除載體；
S2、建立豬成纖維細胞系；
S3、基因敲除載體轉染豬成纖維細胞系；
S4、篩選和陽性克隆鑒定獲得MC3R基因純合敲除的單克隆細胞；
所述步驟S1中基因敲除載體包括sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的CRISPR/Cas9基因敲除載體和sgRNA的核苷酸序列如SEQID NO:2所示的CRISPR/Cas9基因敲除載體；
所述步驟S3中基因敲除載體轉染豬成纖維細胞系的具體過程包括：
將經解凍和傳代的成纖維細胞進行培養，培養液為含10％體積分數胎牛血清的DMEM培養液，待細胞匯合度達70-80％時，利用改良胰蛋白酶消化液消化細胞20-30s后，終止消化，將所述基因敲除載體，px459v2和電擊轉染液混合后重懸細胞，進行電擊轉染；
每升所述改良胰蛋白酶消化液的制備方法為：準確稱取EDTA 0.5g，右旋葡萄糖1.0g，PBS粉末9.6g，Tris堿3.0g，2-乙基-3-羥基-4-吡喃酮0.3g，用900mL超純水溶解，調pH值至7.6，然后加胰蛋白酶1g，溶解后定容至1L，用0.2μm膜過濾分裝，-20℃保存。
2.權利要求1所述的一種制備MC3R基因敲除的豬成纖維細胞系的方法在制備MC3R基因敲除豬中的用途。
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