[發明專利]一種從土壤樣本中高效擴增微生物DNA的方法

在審

• 申請號: 202010566375.X
• 申請日: 2020-06-19
• 公開（公告）號: CN111733219A
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發明（設計）人: 張慧;張鴻;趙琨;李西清
• 申請（專利權）人: 安徽微分基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6806
• 代理公司: 安徽申策知識產權代理事務所(普通合伙) 34178
• 代理人: 程艷梅

本發明涉及分子生物學技術領域，且公開了一種從土壤樣本中高效擴增微生物DNA的方法，包括以下步驟：步驟1、對土壤樣本進行采集；步驟2、對采集的土壤樣本進行微生物核酸提取；步驟3、對提取到的核酸進行質量檢測；步驟4、原始PCR體系與優化后PCR體系擴增效果比對；步驟5、qPCR驗證：擴增體系中最佳牛血清蛋白(BSA)添加濃度；本發明通過采集腐殖酸、有機物、重金屬離子含量高等特殊土壤樣本，采用Spin Kit for Soil試劑盒提取成功后，PCR擴增失敗。通過優化PCR和qPCR體系，在PCR體系中添加牛血清蛋白(BSA)并摸索最佳濃度，使擴增成功率達100％，大幅度提升了PCR擴增效率。經驗證在PCR體系中添加牛血清蛋白(BSA)對可正常擴增的土壤樣本無影響。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，具體為一種從土壤樣本中高效擴增微生物DNA的方法。

背景技術

土壤微生物是土壤生態系統的重要組成部分，它們是土壤中物質轉化的動力：如；固氮作用，硝化作用、反硝化作用、腐殖質的分解和合成，促進土壤有機質的分解和養分的轉化。目前可培養的微生物僅占環境中總微生物的1％，不依賴于培養技術的分子生物學技術被廣泛應用。近年來隨著新一代高通量測序技術的快速發展和成本的大幅降低，越來越多的科研學者通過測序技術解析土壤微生物群落多樣性。但測序技術的基礎依賴于高質量DNA模板和高效的PCR擴增技術。然而土壤成分復雜，含有大量腐殖酸、重金屬離子等，在提取過程中很難徹底去除，這些物質的殘留不僅會干擾提取過程，還會嚴重抑制后續PCR擴增，導致建庫、測序失敗。因而研發一種從土壤樣本中高效擴增微生物DNA的方法尤為重要。

發明內容

(一)解決的技術問題

針對現有技術的不足，本發明提供了一種從土壤樣本中高效擴增微生物DNA的方法，解決了上述背景技術中所提出的問題。

(二)技術方案

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種從土壤樣本中高效擴增微生物DNA的方法，包括以下步驟：

步驟1、對土壤樣本進行采集；

步驟2、對采集的土壤樣本進行微生物核酸提取；

步驟3、對提取到的核酸進行質量檢測；

步驟4、原始PCR體系與優化后PCR體系擴增效果比對；

步驟5、qPCR驗證：擴增體系中最佳牛血清蛋白(BSA)添加濃度；

步驟6、qPCR驗證：擴增體系中添加牛血清蛋白(BSA)是否對可正常擴增的樣本有影響。

優選的，所述步驟1中的土壤樣本采集步驟為：

(1)、在生活污水區的污泥顆粒總采集5例土壤樣本，分別為S1、S2、S3、S4、S5，其雜質、腐殖酸、有機物無機物、重金屬離子含量高；

(2)、在草坪上下層土壤中采集5例土壤樣本，分別為C1、C2、C3、C4、C5。

優選的，所述步驟2中的土壤樣本微生物核酸提取的步驟為：

(1)、稱取約0.5g的土壤樣本，添加到Lysing Matrix E管中，劇烈震蕩混勻；

(2)、加入978ul的Sodium Phosphate Buffer和122ul的MT buffer，先手搖混勻之后，再震蕩混勻2min；14000g離心15min；

(3)、將上清液移至新的1.5ml離心管中，加入250ulPPS，溫和顛倒混勻約10次，14000g離心15min；

(4)、將上清液轉移到新的5ml離心管中；加入1ml的Binding Matri xSuspension，溫和混勻2min，靜置3min；