[發明專利]丙酮酸響應生物傳感器及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 202010566287.X
• 申請日: 2020-06-19
• 公開（公告）號: CN111690647B
• 公開（公告）日: 2023-03-14
• 發明（設計）人: 劉龍;陳堅;堵國成;李江華;呂雪芹;徐顯皓
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/31
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發明公開了一種丙酮酸響應生物傳感器及其構建方法與應用，本發明通過對插入在P43啟動子上的PdhR結合序列優化以及插入位點進行優化，在本發明中成功構建了不同動態范圍丙酮酸響應生物傳感器，其中最小的動態范圍增加了0.6倍，最高的增加了30.7倍。可以用于細胞中各個基因表達量的精細控制。由于丙酮酸是細胞中的關鍵中心碳代謝物，因此，這些生物傳感器可以根據細胞內丙酮酸含量的變化，動態調控胞內基因的表達水平，從而實現對胞內代謝流的動態控制。本發明獲得的丙酮酸生物傳感器具有良好的特異性，此外其對丙酮酸響應范圍為10?35nmol/g DCW。

技術領域

本發明涉及一種丙酮酸響應生物傳感器及其構建方法與應用，屬于代謝工程技術領域。

背景技術

代謝工程的主旨在于以微生物為宿主，生物質為原料，高效的合成所需的化學品，例如藥物、材料、生物燃料、精細化學品和功能營養品等。然而，傳統的代謝工程技術(產物合成途徑相關基因的過量表達、競爭途徑的敲除以及輔因子的優化等)往往會導致細胞胞內代謝流失衡、原料利用率低下和有毒代謝物積累等問題，從而難以實現化合物產量與生產強度的最大化。此外，傳統的誘變育種方法雖然能夠迅速的獲得大量的突變株，但現有的篩選方法難以從這些突變株中迅速的獲得高產量的目的菌株，比如高效液相色譜-質譜聯用技術，價格昂貴且篩選通量低下。因此，急需找到一種高效的技術或方法應用于微生物的代謝工程改造。

隨著合成生物學技術的發展，生物傳感器被廣泛應用于代謝工程、環境檢測和藥物定期靶向治療等領域。生物傳感器是一類生物來源、能夠識別特定物質并將識別信號最終轉換成為輸出信號的感應元器件。根據生物傳感器識別的物質類型，可將生物傳感器分為響應環境信號、胞外化合物和胞內化合物的生物傳感器。生物傳感器一般具有一個響應信號的功能區和一個實現信號輸出的功能區。目前，大多數的生物傳感器都是通過改造轉錄調控因子或者核糖開關獲得的。轉錄調控因子和核糖開關是生物體內一類能夠響應特定信號，調控胞內相關基因表達的蛋白質或RNA。核糖開關具有結構簡單和調控效果明顯的優點，但是往往特異性較低且穩定性較差。轉錄調控因子雖然結構更為復雜，但具有更高的特異性以及更好的穩定性。因此，轉錄調控因子更加適合應用于高特異性生物傳感器的構建與設計。生物傳感器可被用于設計人工基因回路，動態控制細胞胞內的代謝流，平衡細胞生長與產物合成，從而實現產物的高效合成。此外，生物傳感器相對傳統的代謝物檢測方法，具有更高的靈敏度以及更方便的檢測手段，從而能夠被應用于高產突變株的高通量篩選。因此，生物傳感器目前被廣泛應用于微生物代謝網絡的動態控制、目標產物高產菌株的高通量篩選以及定向進化。

丙酮酸是生物體內連接糖酵解途徑以及三羧酸循環的關鍵中心代謝物，一方面為細胞提供合成其它化合物所需的碳骨架，另一方面流入三羧酸循環為細胞提供必需的還原力以及能量。因此，胞內丙酮酸濃度不僅僅是生物疾病發生的重要檢測對象，同時也是微生物代謝工程改造的重要調控節點。所以，構建的丙酮酸響應生物傳感器能夠應用于胞內丙酮酸濃度的監測以及微生物中心碳代謝的動態控制，實現目標產物的高效合成。

目前國內外基于天然界存在的丙酮酸響應轉錄調控因子PdhR已經設計一些丙酮酸生物傳感器。2014年，Barros等人基于熒光共振能量轉移技術以及PdhR成功構建了一種丙酮酸酸響應生物傳感器，這個生物傳感器可以應用于胞內丙酮酸濃度的檢測。2019年，中國科學院天津工業生物技術研究所的張大偉等人公開了一篇專利，內容為基于PdhR，啟動子P_ap，報告基因gfp，成功獲得了另一種丙酮酸生物傳感器，并通過構建PdhR突變文庫，獲得了能夠響應不同濃度丙酮酸的PdhR突變體，此類突變體可應用于丙酮酸和其前體化合物高產突變株的高通量篩選。