[發明專利]一種亞甲基藍-納米花、電化學適配體生物傳感器體系及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202010563012.0
• 申請日: 2020-06-19
• 公開（公告）號: CN111537584A
• 公開（公告）日: 2020-08-14
• 發明（設計）人: 萬家余;卜勝君;劉文森
• 申請（專利權）人: 軍事科學院軍事醫學研究院軍事獸醫研究所
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/48
• 代理公司: 長春眾邦菁華知識產權代理有限公司 22214
• 代理人: 于曉慶

一種亞甲基藍?納米花、電化學適配體生物傳感器體系及其制備方法和應用，涉及食源性致病菌快速檢測領域。本發明的一種亞甲基藍?納米花，其組成成分為：亞甲基藍、抗菌肽、CuSO₄和磷酸鹽緩沖液PBS，制備過程為：取離心管，依次加入亞甲基藍、抗菌肽懸浮于800～1500μL、10mM的磷酸鹽緩沖液PBS中，該磷酸鹽緩沖液PBS中含有20μL、120mM的CuSO₄，經震蕩混勻、常溫靜置孵育12～24h后，10000rpm離心3～5min，棄上清后加入100μL、0.1mM的磷酸鹽緩沖液PBS懸浮，4℃保存備用。本發明簡單、快速、易于操作、實驗成本低、靈敏、特異性強，具有良好的應用前景。

技術領域

本發明屬于食源性致病菌快速檢測技術領域，具體涉及一種亞甲基藍-納米花、電化學適配體生物傳感器體系及其制備方法和應用。

背景技術

由于食源性致病菌可以通過食物和飲用水等途徑進行傳播，對人類健康構成嚴重危險，每年全球都有數百萬人因食源性致病菌引起的傳染病而導致住院甚至死亡，造成了嚴重的經濟損失。食源性致病菌已經成為威脅人類生命安全的重要因素，是全球人類死亡的主要原因之一。因此，在臨床微生物學領域中建立一種快速、可靠和有效的食源性致病菌檢測方法顯得至關重要。

目前，用于鑒定食源性致病菌的標準培養和菌落計數方法需要幾天才能準確檢測，耗時時間長；另外，已經研發了幾種基于核酸擴增(例如PCR)或免疫學反應(例如ELISA)的傳統檢測方法，然而，這些方法都具有一定的缺點，例如耗時且勞動強度大，并且其應用仍然受到限制。

發明內容

本發明的目的是提供一種亞甲基藍-納米花、電化學適配體生物傳感器體系及其制備方法和應用，以解決現有食源性致病菌檢測方法存在的上述諸多問題。

本發明為解決技術問題所采用的技術方案如下：

本發明的一種亞甲基藍-納米花，其組成成分為：亞甲基藍、抗菌肽、CuSO₄和磷酸鹽緩沖液PBS。

本發明的一種亞甲基藍-納米花的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

取離心管，依次加入亞甲基藍、抗菌肽懸浮于800～1500μL、10mM的磷酸鹽緩沖液PBS中，該磷酸鹽緩沖液PBS中含有20μL、120mM的CuSO₄，經震蕩混勻、常溫靜置孵育12～24h后，10000rpm離心3～5min，棄上清后加入100μL、0.1mM的磷酸鹽緩沖液PBS懸浮，4℃保存備用。

作為優選的實施該方式，所述亞甲基藍的體積為10～100μL、濃度為10μM，所述抗菌肽的體積為0.01～0.1mL。

本發明的一種采用亞甲基藍-納米花構建的電化學適配體生物傳感器體系，該體系包括：亞甲基藍-納米花和修飾巰基的靶標適配體AP。

本發明的采用電化學適配體生物傳感器體系檢測食源性致病菌的方法，包括以下步驟：

步驟一、將修飾巰基的靶標適配體AP于90℃條件下處理5min，冷卻至4℃，保持15min后常溫放置8min，以折疊形成功能結構；

步驟二、將步驟一所得適配體溶液與Au電極共同孵育并成功連接；

步驟三、將得到的適配體修飾電極浸入到不同濃度的待測樣品中，37℃恒溫孵育2h進行清洗，用0.1～0.5mM磷酸鹽緩沖液PBS清洗3次；

步驟四、將亞甲基藍-納米花滴加到步驟三經孵育后的電極上，經孵育后采用差分脈沖伏安法對食源性致病菌進行定量檢測。

作為優選的實施該方式，在步驟二、步驟三、步驟四之后，均采用超純水洗滌電極表面3次。

作為優選的實施該方式，步驟二的具體過程如下：