[發明專利]一種基于RPA對解脲脲原體的快速檢測方法

在審

• 申請號: 202010554846.5
• 申請日: 2020-06-17
• 公開（公告）號: CN111534624A
• 公開（公告）日: 2020-08-14
• 發明（設計）人: 王毅超;謝姣貴;楊合慧;陳曉英;吳波
• 申請（專利權）人: 臺州市中心醫院（臺州學院附屬醫院）
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12R1/35
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產權代理有限公司 11616
• 代理人: 任娜娜

本發明公開的屬于解脲脲原體檢測技術領域，具體為一種基于RPA對解脲脲原體的快速檢測方法，包括以下步驟：材料準備：S1：菌株，S2：試劑；該種基于RPA對解脲脲原體的快速檢測方法，將RPA技術利用于解脲脲原體的快速檢測，同時具有較高的靈敏度和良好的特異性，建立的RPA擴增方法完成對解脲脲原體的快速檢測，與對照病原體相比，僅解脲脲原體呈現經典的擴增曲線；RPA檢測解脲脲原體最低檢出限為3pg；用臨床病例樣本評估檢測效果證明RPA方法具有可行性，能滿足臨床檢測的需要，建立的解脲脲原體實時熒光RPA方法具有高特異度、高靈敏性、簡便快捷等優點，可用于解脲脲原體快速檢測，為進一步的研究提供了可行性以及良好的研究基礎。

技術領域

本發明涉及解脲脲原體檢測技術領域，具體為一種基于RPA對解脲脲原體的快速檢測方法。

背景技術

解脲支原體是一類主要寄居于人體的泌尿生殖道的病原微生物，當機體免疫力下降時，常引起非淋菌性尿道炎(NUG)、宮頸炎、盆腔炎、睪丸炎、附睪炎等疾患，并可引起男女不孕不育，孕期感染可導致流產、早產、胎膜早破等不良妊娠結局，加之此類病原體侵襲破壞泌尿生殖道粘膜上皮細胞，因此更易引起其它性病的繼發感染，是性傳播疾病的重要病原體之一。解脲脲原體屬于條件致病病原體，正常人群中的攜帶者往往不一定出現臨床表征，這很大程度上掩蓋了患者的病情，極易造成漏檢，導致患者錯過最佳治療時間。

目前，臨床檢測解脲脲原體感染的主要方法有培養法和基于聚合酶鏈式反應的檢測方法(PCR)，培養法培養周期較長且容易因為污染造成假陽性結果；PCR需要經歷高溫變性、低溫退火、中溫延伸等熱循環過程，需要有專門溫控設備，而且對實驗條件以及操作人員的要求都較高，比較難以在基層及偏遠地區廣泛應用。

近年來，恒溫擴增技術由于在某一特定的溫度條件就可以進行擴增，因此備受青睞，現在常見的恒溫擴增技術主要包括主要包括環介導恒溫擴增、鏈置換恒溫擴增、滾環恒溫擴增、依賴解旋酶恒溫擴增和重組酶聚合酶恒溫擴增等，恒溫擴增技術相對于傳統方法和PCR而言能夠擺脫精密的溫度循環系統，實現了在缺乏完善的高精密設備的情況下也能進行快速和準確檢測，RPA是一項基于PCR技術發展而來的等溫核酸擴增技術，具有較高靈敏性和特異性；操作便捷；檢測耗時短；結果讀取多樣化以及能夠在等溫條件下對靶DNA進行擴增的優點。

RPA技術以T4噬菌體核酸復制機制為原理,利用重組酶uvsX以及輔助蛋白uvsY和單鏈結合蛋白在常溫下實現引物和模板的特異結合,從而實現目標序列的擴增，在RPA反應中，重組酶uvsX以及輔助蛋白uvsY(uvsY可以提高與ssDNA的親和力，提高uvsX-ssDNA相互作用的穩定性)與上下游引物結合形成核酸蛋白復合體，該復合體會尋找同源的雙鏈DNA，接著，復合體侵入5’端位點形成D環狀，單鏈綁定蛋白(SSB)和親本鏈結合，阻止其與脫離的另一條模板鏈發生相互作用，同時，重組酶uvsX離開引物，降解后被DNA聚合酶利用，之后DNA聚合酶結合在上下游引物的3’端啟動模板合成，進行鏈的延伸，形成新的互補鏈，新合成的互補鏈和原始模板鏈形成雙鏈DNA，以上步驟循環進行，即可實現DNA的指數增長，若引入逆轉錄酶，即可建立RT-RPA。

現有的解脲脲原體檢測RPA方法還存在一些缺點，如低特異度、低靈敏性、繁瑣復雜等缺點，難以快速檢測解脲脲原體，在用于解脲脲原體快速檢測的過程中存在提升空間。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于RPA對解脲脲原體的快速檢測方法，以解決上述背景技術中提出的現有的解脲脲原體檢測RPA方法還存在一些缺點，如低特異度、低靈敏性、繁瑣復雜等缺點，難以快速檢測解脲脲原體，在用于解脲脲原體快速檢測的過程中存在提升空間的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種基于RPA對解脲脲原體的快速檢測方法，包括以下步驟：

材料準備：

S1：菌株，臨床經培養方法確認UU陽性的病原體培養液；臨床確認且經培養得到的病原體培養液；30列臨床女性陰道拭子；