[發明專利]一種基于RPA對解脲脲原體的快速檢測方法

在審

• 申請號: 202010554846.5
• 申請日: 2020-06-17
• 公開（公告）號: CN111534624A
• 公開（公告）日: 2020-08-14
• 發明（設計）人: 王毅超;謝姣貴;楊合慧;陳曉英;吳波
• 申請（專利權）人: 臺州市中心醫院（臺州學院附屬醫院）
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12R1/35
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產權代理有限公司 11616
• 代理人: 任娜娜

1.一種基于RPA對解脲脲原體的快速檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

材料準備：

S1：菌株，臨床經培養方法確認UU陽性的病原體培養液；臨床確認且經培養得到的病原體培養液；30列臨床女性陰道拭子；

S2：試劑；

S3：儀器；

引物、探針的設計與合成：

S1：NCBI數據庫中查獲解脲脲原體16sRNA以及多帶抗原基因特異序列，應用Oligo7設計特異性引物和探針，同時并且在NCBI上對所設計出的引物進行特異性篩選，引物交由生物工程公司合成，其中，引物長度：RPA引物比典型的PCR引物更長，為30～35個核苷酸；引物序列：避免引物中存在不尋常的序列，如一段長序列全由一種特定的核苷酸組成，或存在許多重復的短序列；擴增產物長度：對于超快速的RPA分析，擴增子長度不超過500bp，理想長度為100～200bp：

S2：引物選擇：選擇靶區：GC含量在40％～60％之間；重復序列；很少正向/反向重復、回文等；候選引物：利用PCR軟件如Primer 3、Primer-BLAST進行設計：引物大小最小30，最大36；引物GC％最小20％，最大70％；引物Tm最小50，最大100；最大允許的單核苷酸重復長度設定為5；BLAST驗證；

S3：探針設計：探針由寡核苷酸骨架組成，骨架中包含：一個脫堿基核苷酸類似物；一個側翼dT-熒光團，為熒光素，可使用任何作為dT偶聯試劑用于寡核苷酸合成的熒光團；在THF基團另一側有一個相應的dT-淬滅團，通常是合適的淬滅團[BHQ]；一個合適的3’-修飾基團以阻斷探針的聚合酶延伸；

骨架組合物的選擇：根據試劑盒設計手冊要求選FAM作為熒光團，BHQ1作為猝滅團，C3-間臂作為3’端修飾基團；

S4：探針長度：應為46～52個核苷酸，其中30個位于THF位點的5’端，另外15個位于其的3’端；

S5：條件優化：溫度：根據酶的最適溫度，分別設置37℃、38℃、39℃、40℃、41℃的5個溫度梯度下擴增20min，擴增后的產物立即放在冰上以中止反應的進行，通過凝膠電泳法分析產物，39℃下條帶最亮與試劑說明書一致；

S6：探針選擇：將設計好的兩條探針分別同時對多個陽性樣本進行檢測，通過實時熒光PCR在39℃下進行檢測熒光信號；

模板制備：

S1：將收集到的標本10000轉離心1min，吸凈上清，保留菌體沉淀，向菌體沉淀中加入200μl緩沖液GA，振蕩至沉淀徹底懸浮，向各管加入20μlProteinase K溶液，混勻，各管加入220μl的GB液，振蕩15sec出現絮狀沉淀，全部EP管在70℃金屬浴放置10min，溶液變清亮，瞬離，各管加入220μl無水乙醇，充分振蕩15sec需要無沉淀，瞬離，將上述所得溶液加入吸附柱CB3，吸附柱放入潔凈收集管中，12000轉離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中，向CB3中加入500μl緩沖液GD，GD使用前應先按要求加入規定量的無水乙醇，12000轉離心30sec，倒掉廢液，將CB3放回收集管，向CB3中加入600μl漂洗液PW，PW使用前應先按要求加入規定量的無水乙醇，12000轉離心30sec，倒掉廢液，將CB3放回收集管，重復上一步，將裝有CB3的收集管放入離心機，12000轉離心2min，倒掉廢液，將CB3置室溫數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液，CB3放入干凈的EP管中，向吸附膜的中間部分懸空加入60μl洗脫液TE，室溫放置2～5分鐘，12000轉離心2min，將核酸溶液收集到EP管中，-20℃冰凍保存備用；

S2：篩選RPA最優引物，按試劑盒說明書要求制備每份樣本的再水合溶液：正向引物(10μM)2.4μl、反向引物(10μM)2.4μl、無引物再水合緩沖液29.5μl、模板和水13.2μl(總體積47.5μl)，振蕩并短暫離心，對于每份樣本，將47.5μl再水合溶液轉移至反應微球中，吹打混勻直到整個微球重懸，對于每份樣本，加入2.5μl的280mM醋酸鎂(MgOAc)并充分混勻，如需同時如此處理多個樣本，可將MgOAc加到反應管(8聯排管)的蓋子中，小心蓋緊管蓋，并通過離心使MgOAc進入再水合材料中以激活反應，短暫振蕩并再次快速離心，其中，TwistAmp反應是靠MgOAc來激活，在加入MgOAc后，迅速將樣本置于選擇的孵育溫度下進行孵育，將試管放入合適的恒溫儀中孵育20min，溫度為39℃；

S3：純化產物。