[發(fā)明專利]外泌體聯(lián)合免疫檢查點阻斷劑的腫瘤疫苗及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010554387.0
• 申請日: 2020-06-17
• 公開（公告）號: CN111840528A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發(fā)明（設計）人: 李振華;戴欣悅;張金超
• 申請（專利權(quán)）人: 河北大學
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;A61K39/395;A61K45/06;A61K47/46;A61P35/00
• 代理公司: 石家莊國域?qū)＠虡耸聞账邢薰?13112
• 代理人: 張莉靜

1.一種外泌體聯(lián)合免疫檢查點阻斷劑的腫瘤疫苗，其特征是，所述腫瘤疫苗是以特定的腫瘤抗原Ag激活的樹突狀細胞的外泌體Exo-Ag為載體，利用磷脂-聚乙二醇-琥珀酰亞胺酯DSPE-PEG-NHS為交聯(lián)劑，將PD-L1抗體修飾到外泌體Exo-Ag表面而得到的aPD-L1修飾的腫瘤疫苗Exo-Ag-aPD-L1。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外泌體聯(lián)合免疫檢查點阻斷劑的腫瘤疫苗，其特征是，所述樹突狀細胞為骨髓來源的樹突狀細胞、DC2.4細胞系、外周血樹突狀細胞中的至少一種。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外泌體聯(lián)合免疫檢查點阻斷劑的腫瘤疫苗，其特征是，所述特定的腫瘤抗原Ag為OVA抗原、黑色素瘤相關(guān)抗原 MAGE以及通過細胞或組織破碎提取出的黑色素瘤特異性抗原中的至少一種。

4.權(quán)利要求1所述的腫瘤疫苗的制備方法，包括以下步驟：

（a）培養(yǎng)原代樹突狀細胞：將骨髓細胞均勻分散在細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，以rmIL-4和rmGM-CSF為誘導因子，誘導骨髓細胞分化為樹突狀細胞；

（b）提取外泌體疫苗：將特定的腫瘤抗原Ag與樹突狀細胞共孵育，孵育完成后，收集細胞培養(yǎng)上清液，利用真空過濾器過濾，除去細胞碎片和大顆粒蛋白雜質(zhì)，之后利用超濾離心管進行濃縮除雜，得到外泌體溶液Exo-Ag；

（c）PD-L1抗體修飾Exo-Ag：將磷脂-聚乙二醇-琥珀酰亞胺酯DSPE-PEG-NHS溶于DMSO中，并與經(jīng)離心洗滌后的aPD-L1以1-5∶1的比例混合，并于0-4℃條件下持續(xù)攪拌反應，aPD-L1與DSPE-PEG-NHS通過酰胺化反應連接生成DSPE-PEG-NHS-aPD-L1；反應完成后離心除去未反應的DSPE-PEG-NHS，并將上層溶液的DSPE-PEG-NHS-aPD-L1回收后與Exo-Ag于 0-4℃條件下反應，使DSPE-PEG-NHS-aPD-L1的DSPE端插入到外泌體的膜磷脂雙分子層中，從而得到成功修飾aPD-L1的Exo-Ag-aPD-L1。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征是，步驟（a）中，在細胞培養(yǎng)板中加入含有10-30 ng/mL的rmIL-4和10-30 ng/mL 的rmGM-CSF的RPMI1640培養(yǎng)基，每隔2天，用含有20-60 ng/mL的rmIL-4和20-60 ng/mL的rmGM-CSF的新鮮培養(yǎng)基半量換液，以保持細胞生長環(huán)境中誘導因子濃度不變；樹突狀細胞在第10天使用或進一步成熟后使用。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征是，步驟（a）中，所有培養(yǎng)基均含有100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征是，步驟（b）中，將0.1-0.5 mg/mL 的腫瘤抗原Ag與樹突狀細胞共孵育12-24h后，更換新鮮培養(yǎng)基48 h后收集細胞培養(yǎng)上清液進行過濾。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征是，步驟（c）中，利用10 KDa超濾離心管將aPD-L1溶液離心除去溶劑，并用PBS洗滌并溶解后回收備用。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征是，步驟（c）中，aPD-L1與DSPE-PEG-NHS酰胺化反應的時間為12-24h，DSPE-PEG-NHS-aPD-L1與Exo-Ag于PBS中反應的時間為3-5 h。