[發明專利]一種高效的爬行動物來源的凝血酶及其應用

有效

• 申請號: 202010542620.3
• 申請日: 2020-06-15
• 公開（公告）號: CN111593037B
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 王勇軍;王瑩潔;梁浩
• 申請（專利權）人: 南通大學
• 主分類號: C12N9/74
• 分類號: C12N9/74;A61K38/48;A61P7/04;A61P9/00;A61P17/02
• 代理公司: 南京艾普利德知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32297
• 代理人: 張鉑

本發明公開了一種爬行動物來源的凝血酶，采用基因克隆方法獲取多疣壁虎凝血酶原2(Prethrombin?2)的序列；構建Prethrombin?2真核表達重組質粒，轉染293T細胞，誘導表達Prethrombin?2重組蛋白并純化；利用鋸鱗蝰蛇毒(Ecarin)激活Prethrombin?2重組蛋白，得到具有凝血酶活性的壁虎凝血酶(Gecko Thrombin,gTM)。本發明所述的凝血酶在弱堿性(pH8.0)和37℃的條件下，活性最高，Kcat/Km為13475.41M^?1S^?1；在pH中性條件下，壁虎凝血酶活性顯著高于人的凝血酶活性，提示壁虎凝血酶有望成為一種高效的止血劑，特別是為中樞神經快速止血提供潛在的靶向藥物。

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種高效的爬行動物來源的凝血酶及其應用。

背景技術

凝血酶(Thrombin)是一種多功能的絲氨酸蛋白酶，由凝血因子Xa裂解其前體凝血酶原后形成，是凝血級聯反應中的關鍵酶。凝血酶除了發揮止血功能外，還對神經細胞產生多種影響。由于凝血酶在止血與凝血、組織修復等方面起到極大的作用,已成為國內外研究的焦點。

目前市售的凝血酶制品中大部分來源于人或牛血漿，考慮到使用牛源性凝血酶存在傳播瘋牛病病毒的風險性，人們對重組人凝血酶進行了研究。

凝血酶原2(Prethrombin-2)是α凝血酶(α-thrombin)的前體，由凝血酶原(Prothrombin)切除N端的271個氨基酸產生(不包括N-端43個氨基酸信號肽)。凝血酶原2斷開其Arg320-Ile321之間的肽鍵，形成A亞基和B亞基。B亞基由蛋白鏈和N-糖鏈組成。A、B兩亞基通過二硫鍵連接組成凝血酶，B亞基含有凝血酶的活性功能區，A亞基對凝血酶的活性起穩定作用。Hiroshi等人公開了一種大規模的生產重組人基因型凝血酶的生產系統，以重組Ecarin激活的凝血酶原-2制備高產量的凝血酶。該重組凝血酶與血漿來源的人凝血酶(野生型)活性相似，可用于替代臨床人或牛血漿中提取的酶-凝血酶。(Preparation ofRecombinant α-Thrombin:High-Level Expression of Recombinant HumanPrethrombin-2 and Its Activation by Recombinant Ecarin.J.Biochem.135,577–582(2004))。

自然界中一些低等脊椎動物如兩棲類和魚類具有附肢損傷后可以快速止血并再生相應的組織器官的特點。研究低等脊椎動物的凝血酶的特征及其功能，對開發新的具有止血功能的藥物具有一定的意義。

發明內容

本發明以爬行動物壁虎作為研究對象，克隆了多疣壁虎凝血酶原(Prothrombin)的cDNA序列，該序列開放閱讀框編碼621氨基酸序列(XP_015262498)。本發明對多疣壁虎、人以及小鼠凝血酶原氨基酸序列進行同源比對分析，推測多疣壁虎Prothrombin存在三個切割位點，分別是205-206的Thrombin切割位點(產生凝血酶中間體Prethrombin-1)、316-317的Xa因子切割位點(產生凝血酶中間體Prethrombin-2)和364-365的Xa因子切割位點(產生凝血酶中間體Meizthrombin)。將317-621的氨基酸序列定義為Prethrombin-2，以此為模板，設計引物擴增相應的核苷酸序列，構建了Prethrombin-2真核表達質粒，通過轉染293T細胞，誘導表達、純化得到重組蛋白Prethrombin-2。經Ecarin剪切激活，得到酶活力明顯高于重組人凝血酶的高效凝血酶(最高可達3.63倍，4℃，pH7.0)。

本發明技術方案如下

一種凝血酶原或其片段，來源于爬行動物，具有產生凝血酶原Prethrombin-1的切割位點、產生凝血酶原Prethrombin-2的切割位點和產生凝血酶原Meizthrombin的切割位點中的一種、兩種或三種。