[發(fā)明專利]一種消線法免疫層析試紙及其在CRISPR核酸檢測中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010533739.4
• 申請(qǐng)日: 2020-06-12
• 公開（公告）號(hào): CN111621598B
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李浩;孫巖松;王彥賀;董雪;何雷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6804;C12N15/113;C12N9/22
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 白艷

本發(fā)明公開了一種“消線法”免疫層析試紙及其在CRISPR核酸檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了試劑盒，其包括如下：1)免疫層析試紙；所述免疫層析試紙按樣品流動(dòng)方向依次包括含有膠體金標(biāo)記抗體的樣品墊、含有T線和C線的NC膜和吸水濾紙；所述T線由鏈霉親和素形成；所述C線由所述膠體金標(biāo)記抗體的二抗形成；2)CRISPR反應(yīng)體系；所述CRISPR反應(yīng)體系包括報(bào)告RNA、crRNA和Cas蛋白；所述Cas蛋白為第二類V型或VI型CRISPR系統(tǒng)中的Cas蛋白；本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明了，該試劑盒中的試紙可通過結(jié)合CRISPR核酸檢測系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)多種特定核酸(病原、基因突變、耐藥突變等)的高靈敏、高特異、便捷檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種“消線法”免疫層析試紙及其在CRISPR核酸檢測中的應(yīng)用，屬于分子診斷技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

近年來，CRISPR基因組編輯技術(shù)引發(fā)了生物界巨大的變革。2017年，研究人員發(fā)現(xiàn)了可用于核酸檢測的Leptotrichia wadei Cas13a蛋白(LwCas13a)，通過將其與重組聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Reconbinase polymerase amplification，RPA)結(jié)合，使系統(tǒng)靈敏度提高了100萬倍，并建立了靈敏度達(dá)到單拷貝、特異性達(dá)到單堿基的高靈敏、高特異性核酸檢測方法SHERLOCK(Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)。該系統(tǒng)已用于生物樣本(血液或尿液)中寨卡以及登革熱病毒的檢測以及人體內(nèi)游離的突變腫瘤DNA。

2018年，研究人員通過在報(bào)告RNA兩端分別修飾生物素以及小分子抗原FAM建立了適用于側(cè)向流免疫層析試紙(lateral flow chromatographic assay，LFCA)的 CRISPR-Cas13a核酸快速檢測技術(shù)。和傳統(tǒng)方法相比，側(cè)流層析技術(shù)具有簡便、快速、便攜、可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測及無需專業(yè)操作人員等優(yōu)點(diǎn)。目前適用于CRISPR核酸檢測的 LFCA試紙主要原理為“三明治夾心法”。其具體檢測原理為：在CRISPR反應(yīng)體系中的報(bào)告RNA兩端分別修飾生物素以及FAM，對(duì)于陽性樣品，被Cas蛋白切斷后的雙標(biāo)報(bào)告RNA由于毛細(xì)管作用力從樣品墊側(cè)流至結(jié)合墊，報(bào)告RNA的FAM端會(huì)與膠體金粒子結(jié)合，在層析過程中另一端被鏈霉親和素(C線)捕獲，而被剪切的報(bào)告RNA-FAM- 膠體金粒子復(fù)合體又與T線上的二抗特異性結(jié)合，所以T線與C線同時(shí)顯色；然而在實(shí)際使用過程中，發(fā)現(xiàn)無論陰性還是陽性樣本，在基于這種檢測原理的LFCA試紙檢測中，尤其是樣本濃度較低時(shí)，T線與C線在陰陽性樣本中雖然顏色深淺不同，但均會(huì)出現(xiàn)條帶，這也給主要依賴主觀肉眼觀察的結(jié)果判讀來了一定的困難。

因此，尋找一種新的CRISPR核酸檢測方法是研究的熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種目標(biāo)核酸檢測試劑盒。

本發(fā)明提供的試劑盒，其包括如下：

1)免疫層析試紙；

所述免疫層析試紙按樣品流動(dòng)方向依次包括含有膠體金標(biāo)記抗體的樣品墊、含有T線和C線的NC膜和吸水濾紙；

所述T線由鏈霉親和素形成；

所述C線由所述膠體金標(biāo)記抗體的二抗形成；

2)CRISPR反應(yīng)體系；

所述CRISPR反應(yīng)體系包括報(bào)告RNA、crRNA和Cas蛋白；

所述Cas蛋白為第二類V型或VI型CRISPR系統(tǒng)中的Cas蛋白；

上述CRISPR反應(yīng)體系推薦使用CRISPR-Cas13a反應(yīng)體系，不排除其他CRISPR反應(yīng)體系的應(yīng)用，包括第二類V型、VI型CRISPR反應(yīng)體系(Class II，type V or VI，例如：CRISPR-Cas12a、CRISPR-Cas12b、CRISPR-Cas13b等)；