[發明專利]一種用于SARM1酶促活性檢測的熒光探針及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202010528147.3
• 申請日: 2020-06-11
• 公開（公告）號: CN111574997B
• 公開（公告）日: 2023-02-24
• 發明（設計）人: 李漢璋;李志成;趙永娟;黎婉華;黃軻
• 申請（專利權）人: 北京大學深圳研究生院;香港浸會大學
• 主分類號: C09K11/06
• 分類號: C09K11/06;C07D213/38;C07D213/30;C07D215/14;C12Q1/34
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 李小焦;郭燕

本申請公開了一種用于SARM1酶促活性檢測的熒光探針及其制備方法和應用。本申請的熒光探針由吡啶環與苯烯基或苯烯基衍生物偶聯而成。本申請的熒光探針具有特異性強、靈敏度高和膜透性強等優點，能夠在體外或活細胞內實時檢測SARM1的酶促活性或其激活過程，為SARM1的激活調控機制研究及其參與的軸突變性分子機制研究提供了一種新的檢測物質；并且，本申請的熒光探針能夠用于制備檢測SARM1酶促活性或SARM1酶促活性相關疾病的藥物或試劑盒。

技術領域

本申請涉及線粒體膜蛋白活性檢測領域，特別是涉及一種用于SARM1酶促活性檢測的熒光探針及其制備方法和應用。

背景技術

SARM1蛋白是一個線粒體膜蛋白，早期被認為是調節免疫反應的接頭蛋白。2012年，首次發現SARM1在神經細胞軸突損傷過程中起著重要作用。隨后的研究發現，SARM1蛋白是軸突變性中的關鍵執行蛋白，在果蠅和小鼠的模型中敲除SARM1蛋白都能夠緩解軸突變性過程。而軸突變性是大腦損傷、外周神經病變以及各種神經退行性疾病等的前期事件，所以SARM1是治療這些疾病的重要藥物靶點。

2017年，SARM1的NAD水解酶活性被首次發現。在非激活狀態下，SARM1蛋白呈自抑制構象；當細胞受到信號刺激，神經軸突受損或化療藥物刺激等，其SARM1被激活，大量消耗細胞內NAD，促進軸突變性過程。SARM1的激活調控機制及其參與的軸突變性分子機制仍有待進一步闡釋。

目前，SARM1的檢測方法主要包括兩種：第一種，是利用NAD水解酶和環化酶活性，以NAD類似物如εNAD、NHD、NGD等作為底物檢測熒光生成；第二種，利用SARM1水解NAD生成ADPR、或環化生成cADPR的活性，以NAD為底物，通過HPLC或其他方法檢測底物NAD的消耗和產物ADPR/cADPR/煙酰胺的生成。第一種方法檢測靈敏度低、特異性不強，不能透過細胞膜且所生成的熒光和細胞自發熒光相近而不能用于活細胞檢測，檢測價格昂貴。第二種方法不能進行實時觀察，無法實時獲得SARM1的酶促活性等信息，并且第二種方法檢測所需要的蛋白或細胞等材料較多，只有足夠量的樣本才能進行提取和檢測。

因此，如何有效的實現體外及活細胞中SARM1酶促活性的實時監測，是目前SARM1研究的重點和難點。

發明內容

本申請的目的是提供一種新的指示SARM1酶促活性的熒光探針及其制備方法和應用。

本申請采用了以下技術方案：

本申請的第一方面公開了一種用于SARM1酶促活性檢測的熒光探針，其由吡啶環與苯烯基或苯烯基衍生物偶聯而成。其中，以吡啶環為電子受體基團，以苯烯基及其衍生物為供電子基團。

需要說明的是，本申請的熒光探針是利用SARM1催化的堿基交換反應、設計的一系列吡啶環與苯烯基或苯烯基衍生物的偶聯物，即pyridine conjugates，縮寫為PCs。本申請的熒光探針與NAD的煙酰胺發生交換，形成具有熒光的物質，通過酶標儀檢測底物PCs和產物PADs的吸光波譜動力學以及產物PADs的熒光波譜動力學，表征SARM1的酶促活性。本申請的熒光探針不僅特異性好、靈敏度高，而且膜透性強，能夠在體外或活細胞內實時檢測SARM1的酶促活性或其激活過程。

優選的，本申請的熒光探針為PC1所示結構至PC15所示結構中的至少一種。

更優選的，本申請的熒光探針為PC5、PC6、PC7、PC8、PC10或PC11所示結構。

更優選的，本申請的熒光探針為PC6或PC11所示結構。