[發明專利]多特異性單鏈抗體及其應用

在審

• 申請號: 202010522517.2
• 申請日: 2020-06-10
• 公開（公告）號: CN113773393A
• 公開（公告）日: 2021-12-10
• 發明（設計）人: 黃朝峰;陳煥鵬;韋鳳嬌
• 申請（專利權）人: 廣州長峰生物技術有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N5/0783
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 戴志攀

本發明涉及一種多特異性單鏈抗體及其應用，其從N端到C端依次具有信號肽、第一抗體的可變區序列、第一連接肽和第二抗體的可變區序列，且不具有所述第一抗體和所述第二抗體的恒定區序列；所述第一抗體和所述第二抗體能夠分別特異性地結合T細胞的兩種表面標志抗原，所述可變區序列包括輕鏈可變區序列和重鏈可變區序列，所述輕鏈可變區序列和所述重鏈可變區序列之間通過第二連接肽連接。本發明的多特異性單鏈抗體能有效地從全血中吸附并分離T細胞，簡化了T細胞的分離步驟，減輕了對T細胞的傷害，降低了多步操作帶來的操作失誤風險和設備要求，在T細胞免疫治療中可以降低不同樣本間交叉污染和影響的幾率。

技術領域

本發明涉及生化分子技術領域，特別是涉及一種多特異性單鏈抗體及其應用。

背景技術

T細胞的分離是CAR-T細胞制備的第一個環節，也是T細胞制劑制備中的一項重要技術。目前，從全血中分離T細胞時通常都需要先利用淋巴細胞分離液或者其他密度梯度離心試劑從全血中分離出單核細胞，然后再利用抗體分離技術，通過結合T細胞特征性分子CD3、TCR分子和其他共刺激分子比如CD28等的抗體來分選需要的T細胞。常用的分離技術有磁珠分離、流式分選等方法。

但是，從全血中分離單核細胞的過程需要多次離心，過程較為繁瑣，而且還需要用紅細胞裂解液進行細胞裂解，這對T細胞也有一定傷害，影響了T細胞的活性。

發明內容

基于此，有必要提供一種可用于直接從全血中分離T細胞的多特異性單鏈抗體。

一種用于從全血中分離T細胞的多特異性單鏈抗體，從N端到C端依次具有信號肽、第一抗體的可變區序列、第一連接肽和第二抗體的可變區序列，且不具有所述第一抗體和所述第二抗體的恒定區序列；所述第一抗體和所述第二抗體能夠分別特異性地結合T細胞的兩種表面標志抗原，所述可變區序列包括輕鏈可變區序列和重鏈可變區序列，所述輕鏈可變區序列和所述重鏈可變區序列之間通過第二連接肽連接。

在其中一個實施例中，所述第一抗體為CD3抗體，所述第二抗體為CD28抗體。

在其中一個實施例中，所述多特異性單鏈抗體的C末端還具有標簽序列。

在其中一個實施例中，所述信號肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述第一連接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述第二連接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述標簽序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在其中一個實施例中，所述多特異性單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

一種表達基因，其能夠表達上述多特異性單鏈抗體。

在其中一個實施例中，其核酸序列如SEQ ID NO:6所示。

一種重組細胞，所述重組細胞中含有上述表達基因，或所述重組細胞的基因組整合有所述表達基因。

一種T細胞分離方法，包括以下步驟：在上述多特異性單鏈抗體上標記第一標記物，然后與全血樣品混合得到混合液，利用能夠與所述第一標記物特異性結合的第二標記物從所述混合液中捕獲與所述多特異性單鏈抗體結合的T細胞。

在其中一個實施例中，捕獲與所述多特異性單鏈抗體結合的T細胞的方法包括以下步驟：在所述混合液中加入第二標記物標記的磁珠，孵育后進行磁力分選，得到與所述多特異性單鏈抗體結合的T細胞。

在其中一個實施例中，捕獲與所述多特異性單鏈抗體結合的T細胞的方法包括以下步驟：將所述混合液通過重力滴注的方式流過填充有所述第二標記物包被的細胞培養載體的細胞培養袋，用生理鹽水洗滌所述細胞培養袋，然后加入培養基進行培養。

一種T細胞分離試劑盒，包括上述多特異性單鏈抗體、第一標記物和第二標記物，所述第一標記物和所述第二標記物能夠特異性結合。