[發(fā)明專利]植物改造

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010512913.7
• 申請日: 2020-06-08
• 公開（公告）號: CN111979262A
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 洪益國;張弦
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州師范大學
• 主分類號: C12N15/83
• 分類號: C12N15/83;C12N5/10;A01H5/00;A01H6/46;A01H6/20;C12N7/01;C07K14/005;C12R1/94
• 代理公司: 杭州浙科專利事務(wù)所(普通合伙) 33213
• 代理人: 沈淵琪

本發(fā)明大體涉及用于植物的基因或基因組編輯的方法和材料。本發(fā)明提供用于表達用于編輯植物中的靶序列的完整基因組編輯(GE)系統(tǒng)(比如CRISPR Cas9)的表達系統(tǒng)，所述表達系統(tǒng)包括：至少一個核苷酸序列，所述至少一個核苷酸序列包括：(i)啟動子，(ii)FoMV cDNA，其中，所述啟動子有效連接至FoMV cDNA，所述FoMV cDNA編碼一個或多個重組狐尾草花葉病毒(FoMV)病毒載體，所述一種或多種重組狐尾草花葉病毒載體包括至少一個亞基因組啟動子(SGP)，所述至少一個亞基因組啟動子有效連接至編碼所述GE系統(tǒng)的異源核酸。本發(fā)明還提供適于編輯所述靶標的FoMV RNA轉(zhuǎn)錄本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明大體涉及用于植物的基因或基因組編輯的方法和材料。

背景技術(shù)

基因靶向和基因組編輯(GE)系統(tǒng)對于特定基因靶向或精確基因組編輯具有廣闊的前景，無論是植物基因的功能表征還是農(nóng)作物的遺傳改良。

GE系統(tǒng)通常涉及工程化的核酸酶系統(tǒng)的使用。核酸酶可在靶DNA序列中誘導(dǎo)雙鏈斷裂(DSB) 或切口，使得通過非同源末端連接或同源性定向修復(fù)對斷裂的修復(fù)可導(dǎo)致基因的敲除和/或目標序列的插入(靶向整合)。內(nèi)源基因的調(diào)節(jié)和/或切割可通過使用蛋白質(zhì)和系統(tǒng)來實現(xiàn)，比如鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子(ZFP-TFs)、鋅指核酸酶(ZFNs)、如效應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子(TALE-TFs)的轉(zhuǎn)錄激活子、CRISPR/Cas轉(zhuǎn)錄因子(參見例如Perez-Pinera等人的(2013)Nature Methods 10:973–976)、如效應(yīng)核酸酶(TALEN)的轉(zhuǎn)錄激活子、Ttago核酸酶或?qū)RISPR/Cas系統(tǒng)與經(jīng)工程改造的crRNA/tracr RNA(“單向?qū)NA”)配合使用以指導(dǎo)特異性切割。

在植物中，誘導(dǎo)GE的關(guān)鍵挑戰(zhàn)之一是將整個系統(tǒng)(核酸酶和向?qū)?輸送到細胞中以進行有效表達。這通常是通過整個系統(tǒng)或部分系統(tǒng)的費時費力的植物轉(zhuǎn)化來實現(xiàn)的，但是對于難于轉(zhuǎn)化或頑固地難以轉(zhuǎn)化的物種則無法實現(xiàn)。

瞬時工具箱(比如病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)^5,6，基因互補(VIGC)⁷和開花(VIF)^8,9)已在植物中廣泛使用，并且以前已利用幾種RNA/DNA病毒來表達Cas9-轉(zhuǎn)基因植物中僅GE的sgRNA組分^10-12。

WO2014194190涉及在特定類型載體上引入的DNA分子的分子生物學和基因工程領(lǐng)域的植物基因靶向和基因組編輯方法。

盡管如此，但可以看出，可用于在植物功能基因組學和作物改良中利用GE技術(shù)的通用非轉(zhuǎn)基因策略將為本領(lǐng)域做出貢獻。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明人已提供了使用狐尾草花葉病毒(FoMV)的非轉(zhuǎn)基因ViGE系統(tǒng)，這是能夠感染單子葉植物和雙子葉植物的陽性單鏈RNA花葉病毒，以同時瞬時表達以Cas9、sgRNA和RNAi抑制子p19為代表的GE系統(tǒng)，為了在植物中編輯靶基因。

盡管如上所述，Cas9轉(zhuǎn)基因植物已用于本領(lǐng)域(參見Kaya等人的Plant and CellPhysiology 58.4(2017):643-649)，但認為本發(fā)明是首次從植物病毒載體表達Cas9作為完整瞬時GE表達系統(tǒng)的一部分。

因此，在一個方面中，提供一種用于表達用于編輯植物中靶序列的完整基因組編輯(GE)系統(tǒng)的植物表達系統(tǒng)，所述表達系統(tǒng)包括至少一個核苷酸序列，所述至少一個核苷酸序列包括：

(i)植物活性啟動子，所述植物活性啟動子有效連接至FoMV cDNA；

(ii)FoMV cDNA，所述FoMV cDNA編碼一個或多個重組狐尾草花葉病毒(FoMV)病毒載體，所述一種或多種重組狐尾草花葉病毒載體包括至少一個亞基因組啟動子(SGP)，所述至少一個亞基因組啟動子有效連接至編碼所述GE系統(tǒng)的異源核酸，以及終止子序列；

(iii)終止子序列。