[發明專利]一種利用固氮酶nif基因鑒定滿江紅葉腔中共生固氮藍藻的方法

在審

• 申請號: 202010482079.1
• 申請日: 2020-06-01
• 公開（公告）號: CN111500755A
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發明（設計）人: 陳堅;鄭偉文;陳彬;鄭斯平;鄭益平
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6869;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學俊

本發明提供一種利用固氮酶nif基因鑒定滿江紅葉腔中共生固氮藍藻的方法，屬于生物學領域，采用所述引物：nifH?F：5'?AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC?3'；nifH?R：5'?TTGTTSGCSGCRTACATSGC CATCAT?3'，構建鑒定滿江紅葉腔中共生固氮藍藻的方法，此方法無需對鑒定樣品的微生物進行專門的處理，分離和純化，可進行免培養的鑒別，本發明所提供的方法有助于快速、準確地鑒定藍細菌與不同宿主所組成的共生體系中的固氮微生物的分布狀況。

技術領域

本發明提供一種利用固氮酶nif基因鑒定滿江紅葉腔中共生固氮藍藻的方法，屬于生物學領域。

背景技術

水生植物滿江紅（Azolla），俗稱“紅萍”，是一種生長在淡水水面的蕨類植物，因富含氮素和蛋白質等營養在我國和亞洲農村被用作綠肥和飼料已有數百年歷史。上世紀80年代初，隨著國際上可持續農業的興起，我國對滿江紅研究予以高度重視。農業部在福建省農科院設立了專門的紅萍研究機構，其中“國家紅萍資源圃”征集國內外滿江紅品種資源達200多種。這種細小的植物繁殖快,生物量高，歸因于其葉腔中棲息著一種固氮藍藻，具有將空氣中氮氣的轉化為可供機體使用的氮形式的能力。這種固氮藍藻是屬于革蘭氏陰性細菌的光自養原核生物，故又稱藍細菌（cyanobacterium）。滿江紅與藍細菌共生關系極為密切，藍細菌在滿江紅的有性世代和無性世代中均是以一種全封閉的形式傳遞的。在無性繁殖中，藍細菌隨滿江紅枝葉的裂殖而在葉腔增殖傳遞；在有性世代中，藍細菌進入滿江紅雌性孢子果的囊群蓋中休眠，而等到宿主雌孢子受精萌發后又同步進入幼苗的葉腔中繼續傳遞。因此，滿江紅是一個相對封閉的共生體。

長期以來，人們借助顯微鏡可以觀察到滿江紅的葉腔中共生著的藍藻是由多個細胞串聯成的絲狀體，形態酷似念珠藻（Nostoc），其中含有營光合作用的營養細胞和專司固氮的異形胞。異形胞中的固氮酶可將大氣氮轉化為植物可利用的結合態氮，以NH₄的形態滿足宿主生長對氮素的需求。宿主則蔗糖為主的碳源作為回報。

對于固氮微生物來說，固氮酶(Nitrogenase)的合成是由固氮基因(nif)操縱和調節的。固氮酶復合物主要由兩部分組成: nifH編碼的鐵蛋白( 又稱為固氮還原酶) 和nifDK編碼的鉬鐵蛋白( 又稱為固氮酶)。在固氮菌的基因組中，固氮相關的nif 基因都是作為一個或幾個基因簇存在的，稱為固氮基因簇( nitrogen-fixationgene cluster) ，是生物固氮的遺傳基礎。發現幾乎所有已測序的固氮菌都至少含有6個保守的基因: nifH，nifD，nifK， nifE， nifN和nifB ，并且這6個基因在所有已鑒定的系統中對固氮都是必需的。藍細菌門是一類古老的細菌門類，固氮藍細菌的種類繁多，已知的固氮藍藻的固氮酶由H、D、K三種基因組成。在通常情況下，D、H兩個基因靠在一起，而K基因與它們之間則隔著一段由12000個核苷酸組成的DNA（脫氧核糖核酸）序列。當環境沒有氮源時，它的DNA上的這12000個核苷酸會被切下，使K、D、H基因緊挨在一起形成一個獨立的操縱子，此時固氮酶就開始顯示活力，藍藻體內的生物固氮‘機器’才開始運轉。 由于利用已知的固氮菌nif 基因簇中的共有基因簇的序列可以發現和檢測新的可能的固氮菌，本發明以固氮菌中含有的nifH基因簇為基礎設計引物，通過直接提取滿江紅共生復合體的DNA,用PCR方法擴增出固氮酶基因的片段，高通量測序后通過比對細菌數據庫中的固氮微生物，從而快速準確地鑒定出固氮藍細菌的類別。

發明內容