[發(fā)明專利]一種用于免疫功能調(diào)節(jié)的間充質(zhì)干細(xì)胞藥物及制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010470634.9
• 申請(qǐng)日: 2020-05-28
• 公開（公告）號(hào): CN111603482A
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高連如;張寧坤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 高連如
• 主分類號(hào): A61K35/28
• 分類號(hào): A61K35/28;A61K9/08;A61K47/42;A61P37/02;A61P29/00;C12N5/0775
• 代理公司: 北京豐浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11781
• 代理人: 李學(xué)康

1.一種用于免疫功能調(diào)節(jié)的間充質(zhì)干細(xì)胞藥物，其特征在于，其含有臍帶疏松結(jié)締組織間充質(zhì)干細(xì)胞LCMSCs，所述LCMSCs為從新生兒臍帶內(nèi)胎兒與母體連接界面的疏松結(jié)締組織中提取的未分化的原始間充質(zhì)干細(xì)胞，該間充質(zhì)干細(xì)胞是胚外中胚層來(lái)源的原始未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于免疫功能調(diào)節(jié)的間充質(zhì)干細(xì)胞藥物，其特征在于，所述藥物為注射液，該注射液中還含有人血白蛋白，人血白蛋白在注射液中的濃度為0.9-1.1％。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于免疫功能調(diào)節(jié)的間充質(zhì)干細(xì)胞藥物，其特征在于，所述注射液的規(guī)格為2mL/管，每管中細(xì)胞總數(shù)量為1.9～2.1×10⁷；注射液以生理鹽水配制。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于免疫功能調(diào)節(jié)的間充質(zhì)干細(xì)胞藥物，其特征在于，所述間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs純度為：所述間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs中，代表MSCs純度的CD24+～CD108+細(xì)胞的百分比達(dá)70％以上，代表MSCs中雜質(zhì)細(xì)胞的CD40+細(xì)胞占百分比≤20％。

5.一種用于免疫功能調(diào)節(jié)的間充質(zhì)干細(xì)胞藥物的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括間充質(zhì)干細(xì)胞的制備和藥物的制備，所述間充質(zhì)干細(xì)胞的制備過(guò)程包括：剝離臍帶內(nèi)疏松結(jié)締組織，將剝離下來(lái)的疏松結(jié)締組織采用連貫階梯式培養(yǎng)法培養(yǎng)，該連貫階梯式培養(yǎng)法包括結(jié)締組織培養(yǎng)、細(xì)胞傳代擴(kuò)增培養(yǎng)、3D培養(yǎng)和低氧培養(yǎng)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述間充質(zhì)干細(xì)胞的制備過(guò)程包括如下步驟：

S1:剝離臍帶內(nèi)疏松結(jié)締組織：

所述疏松結(jié)締組織為體蒂分化的黏液性結(jié)締組織，包括臍帶動(dòng)脈、靜脈周圍，臍帶動(dòng)靜脈之間的黏液性結(jié)締組織；

S2:連貫階梯式培養(yǎng)法獲得原始間充質(zhì)干細(xì)胞LCMSCs，具體包括：

S21:組織培養(yǎng)：將剝離下來(lái)的疏松結(jié)締組織，剪成細(xì)塊狀，放入無(wú)菌培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng)，加入無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基，在35-37℃、體積分?jǐn)?shù)為4-6％的二氧化碳、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

S22:傳代擴(kuò)增培養(yǎng)：待細(xì)胞鋪滿瓶底80％后，棄培養(yǎng)基，加入磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶底，棄清洗液，在培養(yǎng)瓶中加入0.125％胰蛋白酶消化0.5-2分鐘，待細(xì)胞收縮后加入無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，形成細(xì)胞懸液，把細(xì)胞懸液移入離心管中，在100-200g離心力下離心，棄上清，再加入無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基混勻，計(jì)數(shù)，按照每75cm²底面積的培養(yǎng)瓶接種0.75-0.85×10⁶細(xì)胞的濃度接種到新的無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放置在35-37℃、體積分?jǐn)?shù)為4-6％的二氧化碳、飽和濕度培養(yǎng)箱擴(kuò)增培養(yǎng)3-4天；

S23:3D培養(yǎng)：待細(xì)胞鋪滿瓶底90％后，棄培養(yǎng)基，加入磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶底，棄清洗液，在培養(yǎng)瓶中加入0.12～0.13％胰蛋白酶消化0.5-2分鐘，待細(xì)胞收縮后加入基無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，形成細(xì)胞懸液，把細(xì)胞懸液移入離心管中，在100-200g離心力下離心，離心后棄上清，加入水凝膠培養(yǎng)基混勻，使細(xì)胞濃度為每毫升0.8-1×10⁵細(xì)胞，此為水凝膠細(xì)胞懸液，在新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入水凝膠細(xì)胞懸液，每個(gè)培養(yǎng)瓶中接種細(xì)胞數(shù)量為0.8-1×10⁶細(xì)胞，在培養(yǎng)瓶中加入交聯(lián)劑，促進(jìn)水凝膠形成膠胨狀，在培養(yǎng)瓶中水凝膠液面上加入無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基，將含水凝膠細(xì)胞懸液的培養(yǎng)瓶放置于35-37℃、體積分?jǐn)?shù)為4-6％的二氧化碳、飽和濕度培養(yǎng)箱擴(kuò)增培養(yǎng)；3D培養(yǎng)6-7天后，細(xì)胞融合70-80％時(shí)加入36-37℃PBS并放置于36-37℃水浴中，40-60min后水凝膠分解形成細(xì)胞懸液，混勻細(xì)胞懸液，將懸液移入離心管中，100-200g離心力離心10-20min，棄上清；

S24:低氧培養(yǎng)：經(jīng)3D培養(yǎng)后的細(xì)胞加入無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為0.8-1×10⁵，加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞的總數(shù)量為0.8-1×10⁶，先將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入35-37℃、體積分?jǐn)?shù)為4-6％的二氧化碳、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁培養(yǎng)60％融合，把細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入氧氣體積濃度為4-6％、35-37℃、飽和濕度的低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8-15h。