[發明專利]一種提高去甲四環素產量的方法

在審

• 申請號: 202010468246.7
• 申請日: 2020-05-28
• 公開（公告）號: CN111763667A
• 公開（公告）日: 2020-10-13
• 發明（設計）人: 王雪峰;韓冰;閆彩潔;鄭萬靜;王繪磚;徐珍;袁昉
• 申請（專利權）人: 河北圣雪大成制藥有限責任公司
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01;C12N13/00;C12N1/20;C12P29/00;C12R1/485
• 代理公司: 石家莊君聯專利代理事務所(特殊普通合伙) 13125
• 代理人: 高寶新

本發明屬于微生物發酵技術領域，具體涉及一種提高去甲四環素產量的方法，包括以下步驟：(1)斜面培養，(2)誘變處理；(3)抗性篩選；(4)菌株初篩；(5)菌株復試；(6)再對步驟(5)篩選得到的菌株進行發酵工藝優化，進一步提高去甲四環素的發酵水平。本發明通過菌種選育和工藝優化，能夠使用去甲金霉素生產菌株生產去甲四環素，并且達到了工業化生產水平，為簡化米諾環素、替加環素等高附加值產品的合成步驟，降低生產成本，具有重要的應用價值。

技術領域

本發明屬于微生物發酵技術領域，具體涉及一種提高去甲四環素產量的方法。

背景技術

四環素類抗生素(Tetracyclines)是一類具有并四苯(Naphthacene)核心結構的廣譜抗生素，包括土霉素(OTC)、金霉素(CTC)、四環素(TC)、去甲金霉素(DMCTC)、去甲四環素(DMTC)、強力霉素、米諾環素、替加環素等(Nguyen F,Starosta AL,Arenz S,Sohmen D,Donhofer A,Wilson DN(2014)Tetracycline antibiotics and resistancemechanisms.Biological chemistry 395(5):559-75)。在這些抗生素中，OTC、CTC、TC、DMCTC和DMTC是天然產物，OTC由Streptomyces rimosus產生，CTC、TC、DMCTC和DMTC由Streptomyces aureofaciens或其突變體產生。

在實際生產中，以去甲金霉素為原料合成去甲四環素(圖1)，然后以去甲四環素為原料合成米諾環素，米諾環素可以進一步合成價值更高的替加環素。去甲金霉素為原料合成去甲四環素的過程需要經過金屬鈀(Pd)催化的高壓氫化脫氯反應，此反應危險并且成本高，所以，如果能夠通過發酵法生產去甲四環素，可以簡化米諾環素、替加環素等合成的步驟，減少危險因素，降低生產成本。然而，去甲四環素(DMTC)的研究報道很少。CN201910693880.8通過敲除金霉素生產菌株S.aureofaciens CGMCC4.1043中編碼甲基轉移酶的ctcK基因，獲得產去甲四環素的工程菌株DMT1，并在此基礎上通過過表達合成簇內激活基因ctcB、抗性基因ctcR、合成基因ctcQ等策略，進一步提高了去甲四環素的產量；CN201911007748.3通過調整發酵罐培養基組成、調整補料配方，配合發酵過程工藝控制，得到了一種使用金色鏈霉菌發酵生產去甲四環素的方法。

在去甲金霉素發酵過程中，去甲四環素是其中雜質之一，產量很低。去甲四環素與去甲金霉素的結構差別是7位缺少氯原子，所以推測合成過程是先合成去甲四環素，然后7位鹵化加氯，合成去甲金霉素。如果能夠通過菌種選育和工藝優化，使發酵主產物由去甲金霉素轉為去甲四環素，用于去甲四環素的生產，則具有重要的應用價值。鑒于此，本發明開發了一種通過去甲金霉素生產菌株Streptomyces aureofaciens(金色鏈霉菌)誘變提高去甲四環素產量的方法。

發明內容

本發明為了解決上述現有技術中存在的問題，提供了一種提高去甲四環素產量的方法。

本發明采用的具體技術方案，一種提高去甲四環素產量的方法，關鍵是，包括以下步驟：

(1)斜面培養：將去甲金霉素生產菌株接種斜面培養基，25-30℃，20％-60％濕度條件下培養10-15天；

(2)誘變處理：斜面培養成熟后將孢子刮下，接種至菌絲培養基，25-30℃，20％-60％濕度條件下220rpm震蕩培養4-10h，然后進行常壓室溫等離子體(ARTP)處理；

(3)抗性篩選：將經ARTP處理的菌懸液進行稀釋、分離，稀釋液涂布在含有100-1000μg/mL去甲四環素的分離培養基上，25-30℃，20％-60％濕度條件下培養10-15天，培養時第一天正置，第二天起倒置培養；