[發(fā)明專利]一種生產去甲四環(huán)素的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010468235.9
• 申請日: 2020-05-28
• 公開（公告）號: CN111793668A
• 公開（公告）日: 2020-10-20
• 發(fā)明（設計）人: 王雪峰;韓冰;閆彩潔;鄭萬靜;王繪磚;徐珍;袁昉
• 申請（專利權）人: 河北圣雪大成制藥有限責任公司
• 主分類號: C12P29/00
• 分類號: C12P29/00;C12N1/20;C12R1/49
• 代理公司: 石家莊君聯(lián)專利代理事務所(特殊普通合伙) 13125
• 代理人: 高寶新

本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術領域，具體涉及一種生產去甲四環(huán)素的方法，將去甲金霉素生產菌株接種斜面培養(yǎng)基，25?30℃，20％?60％濕度條件下培養(yǎng)10?15天；成熟后接種至種瓶培養(yǎng)基，25?30℃，20％?60％濕度條件下220rpm震蕩培養(yǎng)36?50h；種液成熟后，按照5％?10％接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，相同條件下震蕩培養(yǎng)5?8天，發(fā)酵結束，得到去甲四環(huán)素發(fā)酵液；本發(fā)明提高了去甲四環(huán)素的發(fā)酵單位，達到了工業(yè)化生產水平，對米諾環(huán)素、替加環(huán)素等高附加值產品生產過程中簡化合成步驟，減少危險因素，降低生產成本具有重要的意義和應用價值。

技術領域

本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術領域，具體涉及一種生產去甲四環(huán)素的方法。

背景技術

四環(huán)素類抗生素(Tetracyclines)是一類具有并四苯(Naphthacene)核心結構的廣譜抗生素(圖1)，包括土霉素(OTC)、金霉素(CTC)、四環(huán)素(TC)、去甲金霉素(DMCTC)、去甲四環(huán)素(DMTC)、強力霉素、米諾環(huán)素、替加環(huán)素等(Nguyen F,StarostaAL,Arenz S,SohmenD,DonhoferA,Wilson DN(2014)Tetracycline antibiotics and resistancemechanisms.Biological chemistry 395(5):559-75)。在這些抗生素中，OTC、CTC、TC、DMCTC和DMTC是天然產物，OTC由Streptomyces rimosus產生，CTC、TC、DMCTC和DMTC由Streptomyces aureofaciens或其突變體產生。

隨著耐藥菌株的出現(xiàn)和人們對廣譜抗生素的迫切需求，研究者在這些天然產物的基礎上，通過化學修飾，開發(fā)合成了強力霉素、米諾環(huán)素、替加環(huán)素等更加高效的四環(huán)類抗生素，如：以土霉素為原料可以合成強力霉素，以去甲金霉素為原料可以合成米諾環(huán)素、替加環(huán)素等。值得指出的是，2018年有3款四環(huán)素類抗生素獲得FDA批準：Eravacycline、Sarecycline和Omadacycline。因此，提高生物合成類產品的產能具有重要意義。

在實際生產中，以去甲金霉素為原料合成去甲四環(huán)素(圖2)，然后以去甲四環(huán)素為原料合成米諾環(huán)素，米諾環(huán)素可以進一步合成價值更高的替加環(huán)素。去甲金霉素為原料合成去甲四環(huán)素的過程需要經過金屬鈀(Pd)催化的高壓氫化脫氯反應，此反應危險并且成本高，所以，如果能夠通過發(fā)酵法生產去甲四環(huán)素，可以簡化米諾環(huán)素、替加環(huán)素等合成的步驟，減少危險因素，降低生產成本。

在目前的研究中，通過發(fā)酵法合成OTC、CTC、TC、DMCTC的研究很多，并且均已工業(yè)化生產，而去甲四環(huán)素(DMTC)的研究報道很少。CN201910693880.8通過敲除金霉素生產菌株S.aureofaciens CGMCC4.1043中編碼甲基轉移酶的ctcK基因，獲得產去甲四環(huán)素的工程菌株DMT1，并在此基礎上通過表達合成簇內激活基因ctcB、抗性基因ctcR、合成基因ctcQ等策略，進一步提高了去甲四環(huán)素的產量；CN201911007748.3通過調整發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成、調整補料配方，配合發(fā)酵過程工藝控制，得到了一種使用金色鏈霉菌發(fā)酵生產去甲四環(huán)素的方法。

在去甲金霉素發(fā)酵過程中，去甲四環(huán)素是其中雜質之一，產量很低。去甲四環(huán)素與去甲金霉素的結構差別是7位缺少氯原子，所以推測合成過程是先合成去甲四環(huán)素，然后7位鹵化加氯，合成去甲金霉素。在去甲金霉素發(fā)酵過程中，如果能夠通過改變工藝條件，使發(fā)酵主產物由去甲金霉素轉為去甲四環(huán)素，用于去甲四環(huán)素的生產，則具有重要的應用價值。

鑒于此，本發(fā)明開發(fā)了一種通過去甲金霉素生產菌株S.aureofaciens(金色鏈霉菌)生產去甲四環(huán)素的方法及培養(yǎng)基。

發(fā)明內容

本發(fā)明為了解決上述現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供了一種生產去甲四環(huán)素的方法，采用去甲金霉素生產菌株金色鏈霉菌，通過改變培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，用于生產去甲四環(huán)素。