[發明專利]一種適用于質譜鑒定的草莓雌蕊蛋白提取方法

有效

• 申請號: 202010463875.0
• 申請日: 2020-05-27
• 公開（公告）號: CN111592586B
• 公開（公告）日: 2021-12-03
• 發明（設計）人: 裘劼人;王淑珍;柴偉國;童建新;周歷萍
• 申請（專利權）人: 杭州市農業科學研究院
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/14;C12P21/06;G01N30/02;G01N30/86;G01N1/28;G01N1/34
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

本發明公開了一種用于質譜鑒定的草莓雌蕊蛋白提取方法，包括：步驟1)、以草莓花雌蕊作為樣品；步驟2)、蛋白提取；步驟3)、蛋白酶解；最終得凍干肽段。本發明還同時提供了利用上述任一方法所得的凍干肽段進行的質譜鑒定。本發明通過加入氯仿抽提水層提高蛋白提取率；氯仿也為蛋白變性劑，雖然其變性能力弱于酚，但其能溶解酚而不溶于水，因此通過氯仿能將水層中殘留的酚和蛋白萃取至氯仿層。采用本發明的方法，在2小時梯度內3次技術重復共鑒定到紅頰草莓雌蕊蛋白5697個。

技術領域

本發明涉及植物蛋白組學領域，提供一種適用于質譜鑒定的草莓(特別是紅頰草莓)雌蕊蛋白提取方法。

背景技術

雜交授粉是草莓育種的常用手段，而雌蕊可授性強弱是雜交成功的重要影響因素。發育成熟的草莓雌蕊柱頭表面覆有一層親水蛋白膜，經研究報道可能與花粉識別和萌發相關，因此可采用蛋白質組學方法研究雌蕊可授性。紅頰草莓是日本育成的優質大果型品種(杭州市農業科學研究院2006年引進)，是目前草莓雜交育種最常用的母本之一，因此作為本實驗主要研究對象。

草莓等漿果類植物細胞富含多糖、多酚、糖苷類等多種次生代謝物，會干擾蛋白酶解過程，在提取中需要去除。常用的植物蛋白提取方法有丙酮三氯乙酸沉淀法和酚提法，酚提法除雜效率更高，因此是草莓蛋白提取的主要方法。在傳統酚提法中，組織細胞中的蛋白首先溶入提取液水層，再經酚抽提變性溶入酚層，但由于酚能部分(約10％～15％)溶于水相，水層中仍有少量酚和蛋白殘留。本發明擬對傳統的植物蛋白酚提法進行改進，加入氯仿提取步驟，對水層中殘留的蛋白進行進一步抽提，為后續的蛋白組學研究提供基礎。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種適用于質譜鑒定的草莓(特別是紅頰草莓)雌蕊蛋白提取方法。

為了解決上述技術問題，本發明提供一種適用于質譜鑒定的草莓雌蕊蛋白提取方法，包括：步驟1)、以草莓花雌蕊作為樣品；步驟2)、蛋白提取；步驟3)、蛋白酶解；步驟2)依次包括以下步驟：

2.1)、在0.2g樣品中加入800±50μl預冷(3～5℃)的提取液Ⅰ混勻，再加入800±50μl預冷(3～5℃)的提取液Ⅱ進行首次抽提，得到溶液層以及位于底部的細胞沉淀；所述溶液層分為3層，從上至下依次為酚層、中間層和水層；

所述提取液Ⅰ：含0.7M蔗糖、0.1M氯化鉀、0.5M Tris(三羥甲基氨基甲烷)、2％巰基乙醇和50mM EDTA(乙二胺四乙酸)的水溶液，調pH至8.0；

提取液Ⅰ的制備方法為：在1L水中，加入0.7mol蔗糖、0.1mol氯化鉀、0.5mol Tris、20ml巰基乙醇、50mmol EDTA，再用鹽酸調至PH8.0。

所述提取液Ⅱ：苯酚在Tris-HCl緩沖液(pH8.0,1M)中充分飽和的溶液；

2.2)、在步驟2.1)首次抽提所得的酚層中加入600±50μl提取液Ⅰ進行二次抽提，得二次抽提酚層；

2.3)、在步驟2.1)首次抽提所得的中間層和水層中加入800±50μl氯仿進行抽提；去除抽提所產生的水層，將抽提所產生的中間層和位于最下層的氯仿層與上述步驟2.2)所得的二次抽提酚層進行合并；

在所得的合并液中，加入6±1ml預冷(-18～-22℃)的0.1M醋酸銨甲醇，于-18～-22℃靜置(沉淀)12～16小時，離心后棄上清；所得的沉淀經預冷(-18～-22℃)的甲醇清洗(至洗滌液中無色素殘存)，凍干(于-70℃～-20℃凍干至恒重)，得蛋白粉；

2.4)、在步驟2.3)所得的蛋白粉中加入400±50μL裂解液，渦旋后超聲，使蛋白粉溶解(完全溶解)，所得的溶解液離心，取上清為蛋白溶液；

所述裂解液為：8M尿素，0.1M Tris-HCl，1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)，調pH至8.0。