[發明專利]一種適用于質譜鑒定的草莓雌蕊蛋白提取方法

有效

• 申請號: 202010463875.0
• 申請日: 2020-05-27
• 公開（公告）號: CN111592586B
• 公開（公告）日: 2021-12-03
• 發明（設計）人: 裘劼人;王淑珍;柴偉國;童建新;周歷萍
• 申請（專利權）人: 杭州市農業科學研究院
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/14;C12P21/06;G01N30/02;G01N30/86;G01N1/28;G01N1/34
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.一種適用于質譜鑒定的草莓雌蕊蛋白提取方法，包括：步驟1)、以草莓花雌蕊作為樣品；步驟2)、蛋白提??；步驟3)、蛋白酶解；其特征是：所述步驟2)依次包括以下步驟：

2.1)、在0.2g樣品中加入800±50μl預冷的提取液Ⅰ混勻，再加入800±50μl預冷的提取液Ⅱ進行首次抽提，得到溶液層以及位于底部的細胞沉淀；所述溶液層分為3層，從上至下依次為酚層、中間層和水層；

所述提取液Ⅰ：含0.7M蔗糖、0.1M氯化鉀、0.5M Tris、2％巰基乙醇和50mM EDTA的水溶液，調pH至8.0；

所述提取液Ⅱ：苯酚在Tris-HCl緩沖液中充分飽和的溶液；

2.2)、在步驟2.1)首次抽提所得的酚層中加入600±50μl提取液Ⅰ進行二次抽提，得二次抽提酚層；

2.3)、在步驟2.1)首次抽提所得的中間層和水層中加入800±50μl氯仿進行抽提；去除抽提所產生的水層，將抽提所產生的中間層和位于最下層的氯仿層與上述步驟2.2)所得的二次抽提酚層進行合并；

在所得的合并液中，加入6±1ml預冷的0.1M醋酸銨甲醇，于-18～-22℃靜置12～16小時，離心后棄上清；所得的沉淀經預冷的甲醇清洗，凍干，得蛋白粉；

所述步驟2.1)、步驟2.2)、步驟2.3)的抽提均為：冰上顛倒混勻30±5min，于3～5℃離心；

2.4)、在步驟2.3)所得的蛋白粉中加入400±50μL裂解液，渦旋后超聲，使蛋白粉溶解，所得的溶解液離心，取上清為蛋白溶液；

所述裂解液為：8M尿素，0.1M Tris-HCl，1mM PMSF，調pH至8.0。

2.根據權利要求1所述的一種適用于質譜鑒定的草莓雌蕊蛋白提取方法，其特征是：所述步驟3)為：將步驟2)所得的蛋白溶液還原烷基化，超濾除雜后于30～37℃胰酶酶解，所得肽段溶液除鹽后凍干，得凍干肽段。

3.根據權利要求2所述的一種適用于質譜鑒定的草莓雌蕊蛋白提取方法，其特征是：所述步驟3)為：

取含200μg蛋白的蛋白溶液加入50mM NH₄HCO₃定容至100μL，再加入11μL、100mM的DTT溶液，混勻后于37±1℃反應1±0.2h；加入12μL 500mM的IAM溶液，避光室溫反應25～35min；

將所得反應液利用Amicon-Ultra-15超濾管除雜后加入50mM NH₄HCO₃至體積為200μl，加入4μg Trypsin，于37℃酶解12h～16h；酶解完成后，離心；再向超濾管中加入50mMNH₄HCO₃后，離心；得肽段溶液。

4.根據權利要求3所述的一種適用于質譜鑒定的草莓雌蕊蛋白提取方法，其特征是：

所述步驟2.4)的超聲為：于冰水浴中，以1000000焦耳能量、超聲3s間歇5s的模式超聲2min。

5.根據權利要求1～4任一所述的一種適用于質譜鑒定的草莓雌蕊蛋白提取方法，其特征是：所述步驟1)為：取開花一天期的草莓花，將雌蕊液氮研磨成粉，作用樣品。

6.根據權利要求5所述的一種適用于質譜鑒定的草莓雌蕊蛋白提取方法，其特征是：所述草莓為紅頰草莓。

7.利用如權利要求1～6任一方法所得的凍干肽段進行的質譜鑒定方法，其特征是：

凍干肽段用0.1％甲酸水復溶后，經Acclaim^TM PepMap^TM 100 C18液相色譜柱2h梯度在線分離后，進入Q Exactive質譜儀進行DIA模式掃描分析；得到的原始文件導入分析軟件Spectronaut Pulsar，與已有的草莓柱頭蛋白鑒定庫匹配后得到蛋白鑒定結果。