[發(fā)明專利]引物組合、試劑盒、擴(kuò)增方法、A19疫苗檢測(cè)中的應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010460731.X
• 申請(qǐng)日: 2020-05-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111593048A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-08-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 易新萍;馬曉菁;劉麗婭;葉鋒;谷文喜;謝彩云;鐘旗;劉帥;張旭;薛晶;李巖;努爾拜合提·努爾旦;古麗扎提·塔力甫汗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所（新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心）
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04
• 代理公司: 重慶市信立達(dá)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種引物組合、試劑盒、擴(kuò)增方法、A19疫苗檢測(cè)中的應(yīng)用，所述引物的核苷酸序列為SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO.4。所述試劑盒包含有：2×Taq PCR MasterMix，10μM引物組混合液，無(wú)菌雙蒸水，陽(yáng)性對(duì)照品布魯氏菌2308株DNA，陰性對(duì)照品無(wú)菌雙蒸水。本發(fā)明提供的引物組及PCR試劑盒可鑒別區(qū)分自然感染的布病陽(yáng)性牛和A19疫苗免疫牛。與傳統(tǒng)的病原生化鑒定方法相比，本發(fā)明提供的試劑盒操作簡(jiǎn)便、高效特異、生物安全性高、檢測(cè)結(jié)果分析易于標(biāo)準(zhǔn)化，能解決目前牛布病防控中的實(shí)際生產(chǎn)問(wèn)題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種引物組合、試劑盒、擴(kuò)增方法、A19疫苗檢測(cè)中的應(yīng)用，具體涉及一種引物組合、試劑盒、擴(kuò)增方法、鑒別區(qū)分A19疫苗與自然感染病原檢測(cè)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種人畜共患病，簡(jiǎn)稱“布病”。該病主要發(fā)生于牛、山羊、綿羊、駱駝、豬、鹿和犬等家畜和野生動(dòng)物。動(dòng)物發(fā)病的明顯臨床癥狀是公畜睪丸炎和附睪炎，母畜流產(chǎn)、死胎和不孕，可造成畜牧業(yè)重大損失。帶菌的感染動(dòng)物及其污染的產(chǎn)品或環(huán)境是人感染布病的主要傳染源。我國(guó)自2000年以來(lái)，布病流行率呈逐年上升趨勢(shì)，致使肉、奶等產(chǎn)品存在嚴(yán)重的安全隱患，不僅影響牛羊等動(dòng)物產(chǎn)品的對(duì)外貿(mào)易，也對(duì)我國(guó)公共衛(wèi)生安全造成了極大的隱患。

鑒于我國(guó)布病流行地區(qū)牛羊飼養(yǎng)密度相對(duì)高，動(dòng)物基數(shù)大、陽(yáng)性動(dòng)物比例高的現(xiàn)狀，布病流行區(qū)采取以疫苗接種為主、檢疫-撲殺為輔的防控策略。在實(shí)際生產(chǎn)中，我國(guó)牛接種的布病疫苗主要是A19疫苗，其基因分型屬于牛種生物1型。該疫苗為弱毒活疫苗，已在我國(guó)生產(chǎn)應(yīng)用約50余年，為控制牛布病提供了重要保障。但同時(shí)也存在關(guān)鍵技術(shù)缺陷，影響其廣泛使用。首先是A19疫苗活菌在動(dòng)物體內(nèi)殘存時(shí)間較長(zhǎng)，泌乳牛排菌期長(zhǎng)、公牛生殖系統(tǒng)受損害的風(fēng)險(xiǎn)較高，食品公共安全隱患較大；其次是缺乏鑒別診斷標(biāo)記，常規(guī)的布病血清學(xué)檢測(cè)方法無(wú)法區(qū)分疫苗免疫抗體和自然感染抗體，造成疫苗接種牛與布病自然患病牛無(wú)法甄別，法定檢疫措施嚴(yán)重受阻，病原擴(kuò)散蔓延造成的疫情狀態(tài)難以消除，使布病防控耗時(shí)費(fèi)力且控制困難重重。

近十年家畜布病流行病學(xué)研究數(shù)據(jù)表明，我國(guó)牛布病主要以羊種和牛種3型布魯氏菌為優(yōu)勢(shì)菌種型的流行病學(xué)特征，目前牛布病防控的A19疫苗屬于牛種1型。鑒于以上牛布病布魯氏菌的流行病學(xué)特征，經(jīng)典的布魯氏菌分類鑒定采取的主要方法是從菌株的形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)特征及免疫學(xué)特性加以鑒定。但該鑒定方法耗時(shí)、判讀結(jié)果繁瑣、實(shí)驗(yàn)過(guò)程均以活菌為實(shí)驗(yàn)材料，存在實(shí)驗(yàn)室生物安全隱患。PCR方法以其敏感、特異、安全等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于布魯氏菌的鑒定，AMOS-PCR法可鑒別區(qū)分布魯氏菌部分種型，但無(wú)法鑒別區(qū)分A19疫苗及其他牛種生物亞型的布魯氏菌。

通過(guò)上述分析，現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題及缺陷為：

(1)A19疫苗為弱毒活疫苗，常規(guī)的布病血清學(xué)檢測(cè)方法無(wú)法區(qū)分疫苗免疫抗體和自然感染抗體，造成疫苗接種牛與布病自然患病牛無(wú)法甄別，法定檢疫措施嚴(yán)重受阻，從而引起布病防控中無(wú)法控制和監(jiān)督動(dòng)物移動(dòng)。

(2)經(jīng)典的布魯氏菌分類鑒定采取的主要方法是從病料中分離培養(yǎng)并獲得純化的布魯氏菌(時(shí)間周期為7d)，該實(shí)驗(yàn)過(guò)程中布魯氏菌分離率低，且常規(guī)生化鑒定方法耗時(shí)(時(shí)間周期為3d)、判讀結(jié)果繁瑣、實(shí)驗(yàn)過(guò)程均以活菌為實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中菌量濃度較大，存在實(shí)驗(yàn)室生物安全隱患，必須在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室完成。