[發(fā)明專利]一種利用特征標(biāo)識(shí)肽段鑒別三文魚種類的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010460121.X
• 申請(qǐng)日: 2020-05-27
• 公開（公告）號(hào): CN111474281B
• 公開（公告）日: 2022-08-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳穎;張九凱;馬聰聰;韓建勛;邢冉冉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C07K7/06
• 分類號(hào): C07K7/06
• 代理公司: 北京天盾知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11421
• 代理人: 宋凌林

1.一種用于檢測三文魚種類的特征多肽組合物 ，其特征在于，包括大西洋鮭（Salmosalar）、大馬哈魚（Oncorhynchus keta）和虹鱒（Oncorhynchus mykiss）的特征多肽，其中：

（1）大西洋鮭區(qū)分于大馬哈魚和虹鱒的特征多肽氨基酸序列為：SEQ ID NO.1：AADTFNFK，SEQ ID NO.2：YIIESVGNIR，SEQ ID NO.3：AAVPSGASTGIHEALELR，SEQ ID NO.4：NGLMIAEIEELR；

（2）大馬哈魚的特征多肽氨基酸序列為：SEQ ID NO.5：LLATLYPAAPPEDK；

（3）虹鱒的特征多肽氨基酸序列為：SEQ ID NO.6：AADSFNFK，SEQ ID NO.7：ISALDLSGDQAALMEMLK。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特征多肽組合物，其特征在于：

SEQ ID NO .1所示特征多肽的質(zhì)荷比（m/z）為457.2；

SEQ ID NO .2所示特征多肽的質(zhì)荷比（m/z）為582.3；

SEQ ID NO .3所示特征多肽的質(zhì)荷比（m/z）為593.6；

SEQ ID NO .4所示特征多肽的質(zhì)荷比（m/z）為694.3；

SEQ ID NO .5所示特征多肽的質(zhì)荷比（m/z）為749.9；

SEQ ID NO .6所示特征多肽的質(zhì)荷比（m/z）為450.2；

SEQ ID NO .7所示特征多肽的質(zhì)荷比（m/z）為953.4。

3.一種檢測三文魚種類的方法，其特征在于：

（1）當(dāng)質(zhì)譜結(jié)果出現(xiàn)與SEQ ID NO .2和/或SEQ ID NO .4所示特征多肽的質(zhì)譜圖相同的譜圖時(shí)，則判斷待測樣本為大西洋鮭（Salmo salar）或含有大西洋鮭（Salmo salar）蛋白；

（2）當(dāng)質(zhì)譜結(jié)果出現(xiàn)與SEQ ID NO .5所示特征多肽的質(zhì)譜圖相同的譜圖時(shí)，則判斷待測樣本為大馬哈魚（Oncorhynchus keta）或含有大馬哈魚（Oncorhynchus keta）蛋白；

（3）當(dāng)質(zhì)譜結(jié)果出現(xiàn)與SEQ ID NO .7所示特征多肽的質(zhì)譜圖相同的譜圖時(shí)，則判斷待測樣本為虹鱒（Oncorhynchus mykiss）或含有虹鱒（Oncorhynchus mykiss）蛋白。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，樣品前處理包括如下步驟：

（1）稱取研磨成肉糜狀態(tài)的三文魚樣品，加入7M尿素和2M硫脲的蛋白提取液提取蛋白，高速低溫離心，收集上清液；

（2）取DTT加入到上清液中，37℃反應(yīng)1小時(shí)；

（3）取IAA加入到已經(jīng)冷卻至室溫的上述反應(yīng)液中，室溫避光反應(yīng)15min；

（4）采用10K濾膜超濾離心，使用碳酸氫銨反復(fù)沖洗濾膜并超濾離心，收集蛋白溶液；

（5）使用Trypsin酶溶液加入到蛋白溶液中37℃酶解6小時(shí)；

（6）在10K濾膜上層加入碳酸氫銨，超濾離心，收集下層的肽段濾液，待上機(jī)檢測。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，高效液相色譜條件為：色譜柱：XbridgePeptide BEH C18色譜柱，2.1mm×150mm，3.5μm，300?；流動(dòng)相A：0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液；流動(dòng)相B：0.1%甲酸和2%水的乙腈溶液；進(jìn)樣量：10μL；流速：0.6mL/min；洗脫程序：0-0.1min，2%B；0.1-0.5min，2%B→8%B；0.5-25min，8%B→22%B；25-31min，22%B→35%B；31-33min，35%B→80%B；33-36min，80%B；36-36.5min，80%B→2%B；36.5-39.9min，2%B。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，質(zhì)譜條件為：電噴霧離子源，正離子反應(yīng)模式，檢測方式：MRM，噴霧電壓：5500V，離子源溫度為600℃，離子源氣體1:60psi；離子源氣體2:50psi；DP:100v，預(yù)定窗口80s，循環(huán)時(shí)間2s。