[發明專利]具有抗皺修復功能的重組纖連蛋白及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 202010438531.4
• 申請日: 2020-05-22
• 公開（公告）號: CN111548410B
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發明（設計）人: 單玉飛;張開岳;左勝涵;吳雅勤;張貴鋒;孔英俊;陳江
• 申請（專利權）人: 江蘇邦特生物科技有限公司;中國科學院過程工程研究所;中科華啟（北京）生物技術研究院有限公司
• 主分類號: C07K14/78
• 分類號: C07K14/78;C12N15/70;A61K8/64;A61Q19/00;A61Q19/02;A61Q19/08
• 代理公司: 鄭州豫乾知識產權代理事務所(普通合伙) 41161
• 代理人: 李保平

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及具有抗皺修復功能的重組纖連蛋白，包括至少一個可以和細胞整合素受體結合的RGD結構域、至少一段可作用于鈉離子通道的鈉離子通道結合肽段，所述RGD結構域與所述鈉離子通道結合肽段之間用包含0?300個氨基酸殘基的多肽連接片段進行連接，同時具有結合鈉離子通道以及整合素受體的能力，促進皮膚修復、代謝更新、增強淡斑減少皺紋效果，涉及其制備方法，采用高密度發酵、超耐受金屬親和層析純化、特異性蛋白酶切除標簽、離子柱精制純化方法，得到的重組纖連蛋白rFN不含純化標簽、純度高、比活力高，制備過程簡單高效、低成本、適用大規模生產，還涉及其在體外貼壁細胞培養、皮膚損傷修復、除皺、淡斑的應用。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及具有抗皺修復功能的重組纖連蛋白、及其制備方法和應用。

背景技術

芋螺肽(Conopeptides)是海洋腹足綱軟體動物芋螺的毒液管和毒囊內壁的毒腺所分泌，芋螺肽的主要成分是一些對不同離子通道及神經受體高專一性的活性多肽化合物。芋螺肽能特異性地作用于乙酰膽堿受體及其他神經遞質的各種受體亞型，還可以作用于鈣、鈉、鉀等多種離子通道。芋螺肽有鎮痛以及舒緩神經緊張的作用，同時不具有成癮性，因此是一種藥物領域的研究熱點。近年已經開始運用于美容領域，主要作用為減弱皺紋。

由于芋螺肽分子量較小、表達較困難，目前國內外主要通過化學合成方法來制備，但這種化學合成的方法操作復雜、成本高、不適合規模化生產，且化學合成得到的芋螺肽結構與天然芋螺肽的結構有區別。

纖連蛋白是一種細胞外基質蛋白，調控了細胞的遷移、粘附、生長、增殖、組織的再生、傷口的修復，在醫療以及美容等方面有重要用途，現有的纖連蛋白雖然可以應用于美容方面，但是其在松弛皺紋、淡斑方面的效果比較有限。

單分子的纖連蛋白上存在多種結構域，分別具有不同的功能，如包括12個纖連蛋白I型重復位點FnI結構域、2個纖連蛋白II型重復位點FnII結構域、15-17個纖連蛋白III型重復位點FnIII結構域。近年來，由于對纖連蛋白功能結構域的研究深入以及重組表達技術的突破，纖連蛋白已經解決了重組表達的問題，主要是分離纖連蛋白具有不同功能的結構域，進行重新組合，獲得具有不同功能的小分子化類人纖連蛋白。

重組纖連蛋白的制備涉及到較為復雜的純化問題，目前重組纖連蛋白的單位體積培養基表達量還在較低的2g/L的水平，遠遠落后于膠原蛋白，純化工藝效率低、成本高，影響重組類人纖連蛋白的應用范圍。

目前重組蛋白多采用親和填料層析進行純化，使用較多的是金屬親和(IMAC)純化填料，其中鎳金屬親和填料已經發展到第三代，分別以三配位亞胺二乙酸(IDA-NI)、四配位胺三乙酸(NTA-NI)以及五配位(SMART-NI)為配基。

使用金屬親和填料純化，通常需要在目的蛋白上引入6個組氨酸標簽，即His-tag標簽，這一標簽最小只有6個氨基酸殘基，水溶性好，通常不影響蛋白的結構與功能，在制藥或者其它His6-tag具有不利影響的用途方面，需要移除His-tag標簽，但是移除His-tag是一個巨大困難，常規的解決辦法是在His6-tag與目的蛋白之間引入一個蛋白酶的酶切位點，粗純化后的融合蛋白經過特定蛋白酶的加工，可以切除標簽，通常使用凝血酶(Thrombin)、活化凝血十因子(FactorXa)、煙草花葉病毒蛋白酶TEV等進行切割，但這些酶往往存在特異性不夠，會在目的蛋白序列內切開甚至切割以后會留下冗余氨基酸殘基；近年來有人發現真核生物的類泛素蛋白SUMO可以特異性的被一種空間識別特異性的蛋白酶ULP1加工，這一過程具有最高底物特異性以及切割效率，如果將SUMO連接到目的蛋白的N端，ULP1蛋白酶切割以后，可以完美的解決切割效率、切割特異性以及冗余殘基的問題。

目前還未見使用芋螺肽與纖連蛋白的FN功能片段融合表達的策略，進行芋螺肽的表達、提高纖連蛋白在松弛皺紋、淡斑方面的效果、并進行規模制造重組纖連蛋白的報道。