[發(fā)明專利]白喉毒素調(diào)控清除免疫細(xì)胞的CD45-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法與應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010438512.1
• 申請(qǐng)日: 2020-05-22
• 公開（公告）號(hào): CN111607614A
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盛劍鵬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 乾元康安（蘇州）生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/90;C12N15/12;A01K67/027;G01N33/569
• 代理公司: 蘇州市方略專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32267
• 代理人: 石磊

1.一種白喉毒素調(diào)控清除免疫細(xì)胞的CD45-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

S1. 酶切線性化BAC Clone CD45-DTR，利用電穿孔法導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞BALB/C ES細(xì)胞，得到插入IRES-DTR至CD45外顯子1位點(diǎn)的BALB/C ES細(xì)胞；

S2. 利用插入IRES-DTR至CD45外顯子1位點(diǎn)的BALB/C ES細(xì)胞，囊胚注射法構(gòu)建插入IRES-DTR至CD45外顯子1位點(diǎn)的CD45-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白喉毒素調(diào)控清除免疫細(xì)胞的CD45-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟S1具體包括以下步驟：

(1) 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞用MEF培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)30Grayγ射線滅活處理后作為滋養(yǎng)層細(xì)胞，BALB/C ES細(xì)胞(以下簡(jiǎn)述為ES細(xì)胞)種在滋養(yǎng)層細(xì)胞上，用ES培養(yǎng)基培養(yǎng)；

(2) 電穿孔法將利用PI-SceI酶切線性化的打靶載體BAC Clone CD45-DTR轉(zhuǎn)入ES細(xì)胞，使BAC Clone CD45-DTR整合至基因組中；

(3) 利用G418陽選，挑選得到插入BAC Clone CD45-DTR的BALB/C ES細(xì)胞克隆；

(4) 提取ES細(xì)胞基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR鑒定。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種白喉毒素調(diào)控清除免疫細(xì)胞的CD45-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟4具體為：

提取ES細(xì)胞基因組DNA為模板，利用序列為SEQ ID NO.17的正向引物和序列為SEQ IDNO.18的反向引物進(jìn)行PCR鑒定，插入BAC Clone CD45-DTR的ES細(xì)胞陽性克隆可見約4.1kb條帶。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白喉毒素調(diào)控清除免疫細(xì)胞的CD45-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟S2具體包括以下步驟：

(1) 插入BAC Clone CD45-DTRBALB/C ES細(xì)胞注射入C57BL/6J囊胚，再接種到假孕的KM母鼠子宮中，出生得到毛色為黑色和白色混雜嵌合體小鼠；

(2) 提取轉(zhuǎn)基因小鼠鼠尾DNA作為模板，PCR鑒定；

(3) 利用白色占比最高的5只雄性轉(zhuǎn)基因嵌合體小鼠F0與BALB/c雌鼠交配，得到毛色為白色的小鼠可能為DC SIGN-DTR轉(zhuǎn)基因雜合小鼠，小白鼠經(jīng)鼠尾PCR鑒定后得到DC SIGN-DTR轉(zhuǎn)基因雜合小鼠，即為F1代小鼠，鼠尾PCR鑒定方法同步驟2；

(4) F1代小鼠與C57BL/6J母鼠雜交進(jìn)行傳代、培育，同時(shí)對(duì)所得的子代小鼠進(jìn)行鼠尾PCR 鑒定，鑒定方法同步驟2，得到F2代小鼠，按相同方法對(duì)小鼠進(jìn)行傳代。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種白喉毒素調(diào)控清除免疫細(xì)胞的CD45-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟2具體為：

提取轉(zhuǎn)基因小鼠鼠尾DNA作為模板，利用序列為SEQ ID NO.19的正向引物和序列為SEQID NO.20的反向引物作PCR鑒定，帶有IRES-DTR的陽性小鼠可見約1.2kb條帶。

6.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的白喉毒素調(diào)控清除免疫細(xì)胞的CD45-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法在研究免疫細(xì)胞功能方面的應(yīng)用。

7.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的白喉毒素調(diào)控清除免疫細(xì)胞的CD45-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法在制備人源化小鼠方面的應(yīng)用。

8.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的白喉毒素調(diào)控清除免疫細(xì)胞的CD45-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法建立清除免疫細(xì)胞小鼠模型的方法，包括以下步驟:在第1、第2、第4、第7天分別腹腔注射DT(20ng/g)，特異性清除小鼠免疫細(xì)胞,建立清除免疫細(xì)胞小鼠模型。