[發明專利]一種具有雙表達盒的GS表達載體及其應用

在審

• 申請號: 202010436157.4
• 申請日: 2020-05-21
• 公開（公告）號: CN113005140A
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 趙麗麗;朱中松;劉忠
• 申請（專利權）人: 魯南制藥集團股份有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種高表達細胞株開發中谷氨酰胺合成酶表達載體的構建及應用。本發明所提供的谷氨酰胺合成酶表達載體具有第一表達盒元件，第二表達盒元件，谷氨酰胺合成酶表達元件，氨芐青霉素β內酰胺酶水解酶表達元件，復制起始位點ORI，該載體被命名為PGS?2，利用該構建的谷氨酰胺合成酶表達載體可同時表達兩個蛋白，或者表達一個蛋白的兩個亞基，最后進行組裝，與現有方法相比具有更好的操作便利性，且蛋白表達量提高了8倍以上。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種高表達細胞株開發中谷氨酰胺合成酶表達載體的構建及應用。

背景技術

縱觀2018年，全球暢銷藥物排行榜，最暢銷的10大藥物中，生物技術蛋白類藥物，占了9席，抗體藥王修美樂(Humira)自2012年來一直居首位，2018年銷售199.36億美金。蛋白類藥物已經成為藥物市場的主力軍，在腫瘤類疾病，血管類疾病，風濕類疾病，高血壓等疾病中，均有亮眼的表現。

生物技術的發展也是日新月異，蛋白類藥物從細胞因子、Fc融合蛋白、單克隆抗體、納米抗體到雙特異性抗體，逐步進化，并且隨著現代培養基技術、細胞株和載體的改造技術的進步，細胞的表達量在逐漸的上升，抗體表達量也從mg/L到g/L。

在哺乳動物細胞大規模生產中，常用的可擴增選擇標志基因最常用的基因篩選擴增系統有二氫葉酸還原酶系統(DHFR)和谷氨酰胺合成酶系統(GS)。二氫葉酸還原酶能夠被葉酸類似物氨甲喋呤(MTX)所抑制，含有的目的基因及與之相連的DHFR篩選標記基因在MTX的濃度不斷提高的條件下，兩個基因偶聯，進行擴增數千倍，從而提高目的基因的表達量。谷氨酰胺合成酶系統(GS)是最近新發展的基因篩選擴增系統，較DHFR系統有明顯的優越性，目前在國際上得到了廣泛地認可，系統中加入谷氨酰胺合成酶的抑制劑蛋氨酸磺酰胺(MSX)，可使GS基因及與之相連的目的基因擴增，達到提高目的基因表達水平的目的。GS系統相比于DHFR系統有更好的應用便利性，GS系統只需要一輪加壓，就可完成表達細胞株的篩選，不需要多輪加壓，提高蛋白的表達量，而DHFR系統需要多輪的逐漸加壓，時間周期長，操作繁瑣。并且GS系統在大規模發酵培養時無需添加谷氨酰胺，利用細胞內的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺，避免谷氨酰胺分解造成體系中氨濃度過高，造成對細胞的損傷，降低了成本，降低了工藝控制難度，細胞在大規模開發中有更好的表現。

目前，市場上表現較好的細胞株有Lonza公司的CHOK1SV GS-KO細胞株、Merk公司(原SAFC)的CHOZN CHO K1細胞株和Horizon Discovery公司的CHO GS null細胞株。Lonza和Merk公司是用ZFN技術進行GS基因敲除，Horizon Discovery公司是用rAAV病毒技術進行GS基因敲除。國內有多家公司分別引進了不同的細胞表達系統，進行蛋白的表達，但是這些系統的使用費一般在幾百萬到上千萬，甚至還有上市后藥物的銷售分成，嚴重限制這些系統的使用。現急需開發一款適合我們自己的表達量較高的細胞表達系統。Lonza公司的PXC17.4載體和PXC18.4載體，為兩個載體的組合，表達一個蛋白時用PXC17.4載體，表達兩個蛋白時，兩個蛋白分別克隆入PXC17.4載體和PXC18.4載體，并且通過酶切，連接，構建一個含有兩個表達盒的表達體系，操作繁瑣。專利CN104195173公布了一個具有雙表達盒的谷氨酰胺表達載體，也含有兩個表達盒，但是其在實施例中的表達量僅有600mg/L，表達量偏低，嚴重限制其應用。我們針對目前對表達體系的需求，開發了一款表達量較高的GS雙表達盒表達載體，表達量較高，已經在多種蛋白上成功使用。

發明內容

本發明公布了一種具有雙表達盒的谷氨酰胺合成酶表達載體，以及該載體在制備抗體中的應用，從而解決現有技術中的產物的產率低、操作繁瑣、價格高等問題。

本發明的第一個目的在于提供一種谷氨酰胺合成酶表達載體，其具有兩個蛋白表達盒，可同時表達兩個蛋白，或者表達一個蛋白的兩個亞基，最后進行組裝，該載體被命名為PGS-2。