[發明專利]MPT64蛋白的檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202010423197.5
• 申請日: 2020-05-19
• 公開（公告）號: CN113684245A
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 尹小毛
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學第五附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/6804
• 分類號: C12Q1/6804
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 戴志攀

本發明涉及一種MPT64蛋白的檢測試劑盒及檢測方法，檢測試劑盒包括第一抗體、第二抗體、模板DNA、脂質體原料和擴增引物對；其中，所述第一抗體和所述第二抗體能夠與MPT64蛋白特異性結合，所述擴增引物對能夠特異性擴增所述模板DNA。本發明的檢測方法用第一抗體直接包被PCR反應管，用其代替免疫脂質體PCR方法中的酶標板形式，并以改進的免疫脂質體技術為基礎建立MPT64蛋白快速超敏檢測方法，提高了免疫脂質體PCR的簡易性，而且能夠進一步提高蛋白質檢測的靈敏度。

技術領域

本發明涉及生物檢測技術領域，特別是涉及一種MPT64蛋白的檢測試劑盒及檢測方法。

背景技術

盡管結核病在全球范圍內得到了有效控制，但我們離消滅結核病的目標還有很長一段距離。近年來，全球人口流動的加劇、艾滋病合并結核病感染病例的上升、耐多藥及泛耐藥結核病的增多給結核病防治帶來了巨大挑戰。與此同時，結核病診斷治療領域特別是早期診斷方面進展甚微，現有的各種結核病快速診斷技術均不能同時滿足簡便、準確和廉價的要求。面對嚴峻的結核病防治形勢，發展和應用新的快速診斷方法已成為結核病臨床研究的核心內容。當前結核桿菌(TB)的實驗室診斷主要依賴于傳統的涂片、培養法，但這些方法操作繁瑣、檢測周期長，已遠不能滿足臨床TB快速診斷的需求。近年來發展起來的一些快速診斷方法，如實時熒光PCR、細胞免疫檢測方法等，雖然解決了診斷時效的問題，但是在診斷準確性方面卻不如人意。

MPT64蛋白是結核分枝桿菌在培養早、中期分泌釋放于菌體外并游離于培養基中的一組蛋白，由RD2區基因Rv1980c編碼，相對分子質量為24000，約占結核分枝桿菌培養基上清濾過液中蛋白總量的8％。因此，MPT64蛋白可以作為結核分枝桿菌快速診斷的靶蛋白。

免疫脂質體PCR技術是近幾年才建立并逐步發展的一種新的蛋白質超敏檢測方法，其在醫學領域特別是疾病診斷方面應用前景十分可喜。其檢測靶蛋白的基本原理是：首先用抗靶蛋白抗體包被酶標板孔，接著加入待測標本，孵育一定時間后加入生物素化的抗靶蛋白抗體，然后分別加入親和素和生物素化脂質體，反應一段時間后洗板去除游離的生物素化脂質體，用破膜劑破壞脂質體而使其包裹的DNA片段釋放入溶液中，吸取少量溶液進行Taqman實時熒光PCR，擴增Ct值的大小即可反映出待測標本中靶蛋白的濃度。美中不足的是，現有的免疫脂質體PCR技術不能實現單管檢測，而且整個操作過程比較復雜繁瑣。

發明內容

基于此，有必要提供一種可以實現單管檢測、操作快捷簡便的MPT64蛋白的檢測試劑盒。

一種MPT64蛋白的檢測試劑盒，包括第一抗體、第二抗體、模板DNA、脂質體原料和擴增引物對；其中，所述第一抗體和所述第二抗體能夠與MPT64蛋白特異性結合，所述擴增引物對能夠特異性擴增所述模板DNA。

在其中一個實施例中，所述模板DNA的序列如SEQ ID NO：1所示。

在其中一個實施例中，所述擴增引物對的序列分別如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

在其中一個實施例中，還包括PCR緩沖液、熒光探針和DNA聚合酶。

在其中一個實施例中，所述脂質體原料包括膽固醇、卵磷脂和磷脂酰乙醇胺。

在其中一個實施例中，還包括乙醚、氯仿、戊二醛和BSA。

在其中一個實施例中，所述第一抗體為鼠源抗體，所述第二抗體為兔源抗體。

本發明還提供了一種非疾病的診斷和治療目的的MPT64蛋白的檢測方法，包括以下步驟：

用能夠與MPT64蛋白特異性結合的第一抗體包被PCR反應管，得到包被反應管；

用能夠與MPT64蛋白特異性結合的第二抗體標記包裹有模板DNA的脂質體，得到免疫脂質體；